نيو إنجلاند بيولابس، M1100L، مزيج NEBridge® الرئيسي لليغاز

الفئات ذات الصلة: إنزيمات ربط الحمض النووي، تجميع الحمض النووي، مجموعات الاستنساخ والطفرات. التطبيقات: حلول الاستنساخ عالية الإنتاجية والأتمتة، مواصفات تجميع NEBridge® Golden Gate. المواد المطلوبة (غير المرفقة): شظايا الحمض النووي التي يحددها المستخدم، اختيار المستخدم لإنزيمات التقييد من النوع IIS من NEB، خلايا مؤهلة، مواد أخرى للتحويل. الأسئلة الشائعة : س: هل يمكن استخدام إنزيمات التقييد من النوع IIS من شركات أخرى مع مزيج NEBridge Ligase Master Mix؟ ج: لم يتم اختبار إنزيمات التقييد من النوع IIS من شركات أخرى، والتي لها مواصفات مختلفة، مع مزيج NEBridge Ligase Master Mix. توصيات الاستخدام المقدمة هي نتيجة تحسينات مكثفة. لا يُنصح باستخدام إنزيمات غير تابعة لشركة NEB ولا يتم دعمها. يُرجى اتباع شروط التفاعل الموجودة في صفحة بروتوكول المنتج. س: هل يمكنني تجميع مضخمات PCR بدلاً من الإدخالات المستنسخة مسبقًا باستخدام بروتوكولات ومنتجات Golden Gate Assembly؟ ج: نعم. بالنسبة للاستنساخ بإدخال واحد، يمكنك استخدام مضخمات غير منقاة، ولكن توقع انخفاض الأداء مقارنةً بالمضخمات المنقاة. لتجميع عدة قطع مُدخلة، يجب تنقية المُضخّمات. وللحصول على تنقية فعّالة للمُضخّمات من مُكوّنات تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، نوصي باستخدام مجموعة Monarch® PCR and DNA Cleanup Kit (NEB #T1030). س: كيف يعمل مزيج NEBridge Ligase Master Mix في تجميع Golden Gate؟ وكيف يُقارن بالبروتوكولات المُعدّة منزليًا؟ ج: تم تحسين تجميع Golden Gate باستخدام مزيج NEBridge Ligase Master Mix مع سبعة إنزيمات تقييد من النوع IIS من NEB لتحقيق كفاءة ودقة عاليتين، حتى مع التجميعات المُعقدة التي تضم 25 قطعة. اعتمادًا على مدى تعقيد تفاعل التجميع واختيارك لإنزيم التقييد من النوع IIS، يُمكنك توقع الحصول على 106-108 وحدة تشكيل مستعمرة لكل ميكروغرام من الحمض النووي الناقل، مع معدل تجميع صحيح يتجاوز 80%. نُدرك أن العديد من العملاء يُفضلون إعداد هذه البروتوكولات بأنفسهم. ومع ذلك، نأمل أن يُساعدك اختيار هذا الكاشف على إزالة عقبة تقنية من سير عملك وتحقيق تجميعات أكثر نجاحًا. س: لاحظتُ وجود تشوهات خلفية عالية مع ناقل فارغ عند استخدام مزيج NEBridge Ligase Master Mix. ما العمل؟ ج: نقترح إجراء التحويل فور انتهاء التفاعل. إذا خزّنتَ التفاعلات عند درجة حرارة -20 درجة مئوية طوال الليل أو لفترة طويلة، فستحتاج إلى حضانة أخرى عند درجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة 5 دقائق قبل التحويل مباشرةً. تُفضّل درجة حرارة 60 درجة مئوية نشاط إنزيم التقييد على نشاط إنزيم T4 DNA Ligase، ويمكنها تقليل التشوهات الخلفية عن طريق هضم أي ناقل "مُعاد ربطه" لا يزال يحمل موقع إنزيم التقييد. س: تجمد مزيج NEBridge Ligase Master Mix في المُجمّد. هل هذه مشكلة؟ ج: لا. يبقى مزيج NEBridge Ligase Master Mix سائلاً بشكل عام أثناء التخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. ومع ذلك، تختلف درجات حرارة المُجمّد، وإذا تم تخزينه تحت درجة حرارة -20 درجة مئوية، فقد يتجمد. أجرت شركة NEB اختبارات التجميد والذوبان على هذا المنتج. بعد 50 دورة تجميد وذوبان، احتفظ بأكثر من 80% من نشاطه الأصلي. س: هل يمكن تعطيل تفاعلات مزيج NEBridge Ligase Master Mix بالتسخين؟ ج: عند إجراء عملية تجميع Golden Gate باستخدام هذا المنتج، لا داعي لتعطيله مسبقًا. مع أن الإنزيمات ستتعطل عند التسخين المفرط، إلا أن مكونات محلول التفاعل قد تُشكّل مُركّبًا مع ناتج الحمض النووي وتؤثر سلبًا على كفاءة التحويل. س: هل يُمكنني استخدام تفاعل مزيج NEBridge Ligase Master Mix لتحويل الخلايا المؤهلة كهربائيًا؟ ج: نعم. كفاءة تحويل الخلايا المؤهلة كهربائيًا أعلى بعشر مرات من الخلايا المؤهلة كيميائيًا. لقد اختبرنا التحويل المباشر لتفاعلات NEBridge باستخدام بكتيريا E. coli المؤهلة كهربائيًا NEB 10-beta (NEB #C3020). عند اتباع بروتوكول التحويل الكهربائي المُرفق مع NEB 10-beta، وباستخدام 1 ميكرولتر من تفاعل Golden Gate Assembly مع 25 ميكرولتر من خلايا NEB 10-beta المؤهلة كهربائيًا، لم نواجه أي مشاكل، مثل حدوث شرارة كهربائية. س: ما هي إنزيمات التقييد المُستخدمة في عملية تجميع Golden Gate؟ ج: تُعدّ تقنية التجميع الذهبي (Golden Gate Assembly) طريقة استنساخ فعّالة أحادية الأنبوب، تعتمد على إنزيمات التقييد من النوع IIS التي تقطع الحمض النووي خارج مواقع التعرف الخاصة بها، تاركةً نهايات بارزة بطول 3 أو 4 قواعد. يُعدّ إنزيم BsaI أكثر إنزيمات النوع IIS استخدامًا في هذه التقنية. كما تُقدّم شركة NEB نسخة مُهندسة عالية الدقة من هذا الإنزيم، BsaI-HF®v2، والتي تتميّز بميزة إضافية وهي كونها مُؤهّلة لتوفير الوقت (حيث يُمكنها هضم الحمض النووي في غضون 5-15 دقيقة أو طوال الليل دون إتلافه)، وتُظهر نشاطًا نجميًا مُنخفضًا بشكل ملحوظ. تشمل إنزيمات النوع IIS الأخرى المُستخدمة في تقنية التجميع الذهبي: BsmBI-v2/Esp3I، وBbsI/BbsI-HF، وPaqCI (نظير AarI مع تسلسل تعرف بطول 7 قواعد)، وSapI/BspQI/BspQI-HF (مع تسلسل تعرف بطول 7 قواعد ونهايات بارزة بطول 3 قواعد). س: ما الذي يؤثر على كفاءة تقنية التجميع الذهبي؟ ج: يُعدّ استنساخ الإدخال الفردي أكثر كفاءةً بشكلٍ ملحوظ من استنساخ الإدخالات المتعددة. تنخفض كفاءة التجميع مع ازدياد عدد القطع. كما أن وجود تسلسلات متكررة في الإدخال يُقلل من الكفاءة. بالنسبة للإدخالات التي يقل طولها عن 250 زوجًا قاعديًا أو يزيد عن 3 كيلوبايت، فإن الاستنساخ المسبق يزيد من الكفاءة. أخيرًا، تنطبق القيود المعتادة على الحجم الإجمالي للبلازميد، والتي تسمح بالحفاظ عليه مستقرًا في بكتيريا الإشريكية القولونية، على تجميعات غولدن غيت. تكون الكفاءة في أعلى مستوياتها مع تركيبات البلازميد المُجمّعة التي يتراوح طولها بين 10 و12 كيلوبايت تقريبًا. يمكن إنتاج تجميعات أكبر حجمًا، ولكن ذلك يتطلب فحص عدد أكبر من المستعمرات للتأكد من الحصول على المنتجات المُجمّعة كاملة الطول الصحيحة. للاطلاع على أمثلة تجريبية توضح العلاقة بين التعقيد والكفاءة، يُرجى الرجوع إلى المذكرة الفنية لتجميعات غولدن غيت. س: كم عدد الأزواج القاعدية التي يجب أن تحتويها إدخالات الأمبليكون الخاصة بي على محيط موقع التقييد من النوع IIS؟ ج: يجب أن تحتوي إدخالات الأمبليكون على قواعد محيطة من الطرف 5' ومواقع تقييد من النوع IIS في كلا طرفي الأمبليكون بالاتجاه الصحيح. نوصي بإضافة ستة قواعد محيطة عند الطرف 5' للبادئات لتحقيق أفضل ارتباط لإنزيم القطع من النوع IIS، وقطع الحمض النووي، وكفاءة تجميع Golden Gate. تتجاوز هذه التوصية المكونة من ستة أزواج من القواعد تفضيلات طول الطرف الأخرى المعروفة لإنزيمات القطع من النوع IIS، نظرًا لأن بروتوكولات تجميع Golden Gate تتطلب أقصى نشاط إنزيمي للتجميع الفعال.