مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، M1202S، إنزيم هيليكاز Tte UvrD

الفئات ذات الصلة: تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR)، وتقنيات التضخيم. التطبيقات: التضخيم المعتمد على الهيليكاز، التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة، تضخيم الحمض النووي، مواصفات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR). شروط التفاعل: عبوة واحدة من محلول التضخيم متساوي الحرارة، مضاف إليها 1 ملي مول من الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)، حضن عند 65 درجة مئوية. عبوة واحدة من محلول التضخيم متساوي الحرارة: 20 ملي مول من Tris-HCl، 10 ملي مول من كبريتات الأمونيوم (NH4)2SO4، 50 ملي مول من كلوريد البوتاسيوم (KCl)، 2 ملي مول من كبريتات المغنيسيوم (MgSO4)، 0.1% من توين 20 (الأس الهيدروجيني 8.8 عند 25 درجة مئوية). الاستخدام: التركيز 0.2 - 0.4 نانوغرام/ميكرولتر. محلول التخزين: 10 ملي مول من Tris-HCl، 100 ملي مول من كلوريد البوتاسيوم (KCl)، 1 ملي مول من ثنائي ثيوثريتول (DTT)، 0.1 ملي مول من حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك (EDTA)، 0.1% من تريتون X-100، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4. تعطيل بالحرارة عند 25 درجة مئوية، ثم عند 80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. الأسئلة الشائعة : س: هل يتطلب إنزيم Tte UvrD Helicase (NEB #M1202) بنية DNA محددة لفك اللولب؟ ج: لا، يمكن لإنزيم Tte UvrD Helicase استخدام أي بنية DNA مزدوجة السلسلة كركيزة لفك اللولب. يشمل ذلك DNA المزدوج والـ DNA المزدوج ذي النهايات المتدلية 3′ و5′ من DNA أحادي السلسلة (1-3). المراجع: An, L., Tang, W., Ranalli, TA, Kim, HJ, Wytiaz, J., and Kong, H. (2005). J Biol Chem 280(32):28952-8. Mauris, J., and Evans, TC Jr. (2010). J Biol Chem 285(15):11087-92. Vincent, M., Xu, Y., and Kong, H. (2004). EMBO Rep 5(8):795-800. س: كيف أستخدم إنزيم Tte UvrD Helicase لتقليل التضخيم غير المعتمد على القالب في تفاعلات LAMP؟ ج: نقترح إضافة 10 نانوغرام من إنزيم Tte UvrD Helicase إلى 25 ميكرولتر من تفاعل LAMP باستخدام مجموعة WarmStart® LAMP (NEB #E1700). يجب إضافة إنزيم Helicase إلى جميع التفاعلات، حيث أن تأثيره ضئيل على أداء التفاعلات التي تحتوي على الحمض النووي DNA أو RNA المستهدف (على الرغم من احتمال انخفاض إشارة التألق؛ إلا أن وقت التفاعل لن يتأثر). بالنسبة للتفاعلات ذات مستويات التضخيم غير المعتمد على القالب العالية جدًا، قد يلزم زيادة كمية إنزيم Helicase. في حال تأثرت الإشارة الإيجابية، يجب تقليل كمية إنزيم Helicase. فيما يلي النطاقات المقترحة للاستخدام في تفاعلات LAMP مع بوليميرازات الحمض النووي المحددة: بوليميراز الحمض النووي Bst، الجزء الكبير (NEB #M0275): 5-10 نانوغرام لكل تفاعل (0.2-0.4 نانوغرام/ميكرولتر) بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0® (NEB #M0537): 10-15 نانوغرام (0.4-0.6 نانوغرام/ميكرولتر) بوليميراز الحمض النووي Bst 3.0 (NEB #M0374): 10-20 نانوغرام (0.4-0.8 نانوغرام/ميكرولتر) س: هل إنزيم Tte UvrD Helicase متوافق مع مزيج WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix (NEB #M1800)؟ ج: لا، لا ينبغي استخدام إنزيم Tte UvrD Helicase مع تفاعل LAMP اللوني. عندما يعمل إنزيم UvrD على ركائز الحمض النووي، فإنه يُحلل dATP، مُطلقًا أيون هيدروجين (H+) مع كل عملية تحلل، تمامًا كما يفعل بوليميراز الحمض النووي عند دمج dNTP. سيؤدي إنتاج البروتونات هذا إلى انخفاض في درجة الحموضة (pH) لمحلول LAMP اللوني، بغض النظر عن أي تفاعل تضخيم، مما يُغير لون جميع التفاعلات التي تحتوي على مزيج WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix وبادئات الأوليغونوكليوتيدات. س: هل أحتاج إلى إضافة ATP لنشاط إنزيم Tte UvrD Helicase؟ ج: إذا كنت تستخدم إنزيم Tte UvrD Helicase لنشاط فك اللولب بشكل مستقل عن أي بوليميراز حمض نووي أو نشاط تضخيم، أو في محلول التضخيم متساوي الحرارة، فنعم، يجب إضافة 1 ملي مولار من ATP إلى خليط التفاعل. أما إذا أضفت إنزيم Tte UvrD Helicase إلى تفاعل تضخيم (على سبيل المثال، إلى مزيج WarmStart LAMP Master Mix)، فسيتم استخدام dATP الموجود في الخليط لفك اللولب. س: هل إنزيم Tte UvrD Helicase نشط في محاليل منظمة أخرى؟ ج: يتم تحقيق النشاط الأمثل باستخدام محلول التضخيم متساوي الحرارة الموصى به والمُضاف إليه 1 ملي مول من ATP، أو في مزيج WarmStart LAMP 2X Master Mix (NEB #E1700). مع ذلك، فإن إنزيم Tte UvrD Helicase نشط في محاليل منظمة أخرى، ويُوضح أدناه النشاط النسبي في بعض المحاليل المنظمة الأخرى المحتملة: المحلول المنظم، النشاط النسبي، NEBuffer 1.1، 100%، NEBuffer 2.1، 100%، NEBuffer 3.1، 75%، CutSmart® Buffer، 100%، محلول التضخيم متساوي الحرارة II، 10%، ThermoPol® Buffer، 100%، WarmStart LAMP Master Mix، 100%. س: هل يُمكنني شراء كميات كبيرة من إنزيم موجود ضمن برنامج Enzymes for Innovation؟ ج: نعم، إذا كنت بحاجة إلى كميات كبيرة من إنزيم ضمن برنامج Enzymes for Innovation، يُرجى التواصل مع شركة NEB عبر البريد الإلكتروني EnzymesForInnovation@neb.com. يرجى العلم بأن التوافر قد يكون محدودًا، وبالتالي قد تطول مدة التسليم للطلبات الكبيرة. كما قد يلزم إجراء اختبارات إضافية لمراقبة الجودة لتلبية احتياجاتكم وتطبيقاتكم الخاصة. س: ما هي إنزيمات الابتكار؟ ج: إنزيمات الابتكار (EFI) هو مشروع أطلقته شركة NEB لتوفير إنزيمات فريدة للمجتمع العلمي، بهدف تمكين اكتشاف تطبيقات جديدة ومبتكرة. تتميز هذه الإنزيمات بخصائص فريدة وتخصصات مميزة غير متوفرة تجاريًا في أي مكان آخر، وبجودة NEB المعهودة. إنزيمات الابتكار هي تلك التي انتقلت من تطبيقات غير معروفة أو استكشافية إلى أن أصبحت حجر الزاوية في تطبيق محدد. إذا كانت لديكم فكرة عن "إنزيم للابتكار" مع تطبيق مقترح قد يكون مفيدًا، يُرجى مراسلتنا عبر البريد الإلكتروني EnzymesForInnovation@neb.com. لمزيد من المعلومات، يُرجى مشاهدة الفيديو.