مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، M1284L، RNase 4

إنزيم RNase 4 هو إنزيم داخلي أحادي السلسلة يعمل على قطع الحمض النووي الريبي (RNA) عند مواقع ثنائي النوكليوتيد يوريدين-بيورين (U/R). التصنيفات ذات الصلة: مواصفات إنزيمات RNase. تعريف الوحدة: تُعرَّف وحدة واحدة من إنزيم RNase 4 بأنها كمية الإنزيم اللازمة لقطع 1.8 بيكومول من ركيزة RNA مكونة من 45 قاعدة تحتوي على موقع قطع U/A واحد خلال 60 دقيقة عند درجة حرارة 25 درجة مئوية. شروط التفاعل: محلول NEBuffer™ r1.1 بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول التخزين: 10 ملي مولار من ثنائي-تريس-بروبان-هيدروكلوريد، 10 ملي مولار من كلوريد المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل من الألبومين المؤتلف (الأس الهيدروجيني 7 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 100 ملي مولار من كلوريد الصوديوم، 50 ملي مولار من أسيتات الصوديوم، 200 ميكروغرام/مل من الألبومين المؤتلف، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 6 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري : لا. الأسئلة الشائعة : س: هل يقوم إنزيم RNase 4 (NEB #M1284) بقطع الحمض النووي الريبي في مواقع أخرى غير U/A وU/G؟ ج: يُفضل إنزيم RNase 4 قطع U/A > U/G >>> C/A. ويُلاحظ انخفاض نشاط C/A عند وجود تركيزات عالية من إنزيم RNase 4 مقارنةً بالحمض النووي الريبي المستهدف. س: ما هي كمية إنزيم RNase 4 (NEB #M1284) التي يجب استخدامها لهضم الحمض النووي الريبوزي (RNA) لرسم خرائط تسلسل النيوكليوتيدات باستخدام تقنية LC-MS/MS؟ ج: إضافة 1 ميكرولتر من إنزيم RNase 4 (NEB #M1284) (50,000 وحدة/مل) تُعطي تغطية تسلسلية قصوى لـ 10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبوزي المُستنسخ في المختبر (IVT) غير المُعدَّل، بطول يتراوح بين 1 و5 كيلوبايت، في تفاعل حجمه 30 ميكرولتر (محلول NEBuffer r1.1 بتركيز 1X، ويوريا بتركيز 1 مولار) يُحضَّن عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. مع ذلك، وكما هو الحال عند استخدام إنزيم RNase T1 أو إنزيم RNase A البنكرياسي البقري، قد يكون العدد الأمثل لوحدات إنزيم RNase 4 المطلوبة أعلى أو أقل بناءً على الحمض النووي الريبوزي المستهدف. يمكن تخفيف إنزيم RNase 4 في محلول NEBuffer r1.1 بتركيز 1X، والمُضاف كمحلول بتركيز 10X. س: ما هي التركيبة الكيميائية للأوليغونوكليوتيدات 5' و3' الناتجة عن التحلل بواسطة إنزيم RNase 4 (NEB #M1284)؟ ج: بعد التحلل بواسطة إنزيم RNase 4، تنتهي الأوليغونوكليوتيدات 5' الموجودة في الطرف 5' باليوريدين، وتحتوي على مجموعة متنوعة من النهايات 3'، معظمها فوسفات 3' أو فوسفات حلقي 2'، 3'. أما الأوليغونوكليوتيدات 3' الموجودة في الطرف 3'، فتبدأ بالبيورين (A أو G) وتحتوي على نهايات 5' مهدرجة. س: ما هي كمية إنزيم RNase 4 (NEB #M1284) التي يجب استخدامها لتحليل mRNA ذي غطاء 5' الموجه بواسطة مسبار الحمض النووي؟ ج: التوصية الحالية هي تخفيف إنزيم RNase 4 (50,000 وحدة/مل) بنسبة 1:30 في محلول NEBuffer r1.1 بتركيز 1X. يكفي إضافة 1 ميكرولتر من إنزيم RNase 4 المخفف في التفاعلات التي تحتوي على 5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي المستهدف المهجن مع 40 بيكومول من مسبار الحمض النووي (2023 Wolf et al. ACS Pharmacol. Transl. Sci.). س: هل يمكن تعطيل إنزيم RNase 4 (NEB #M1284)؟ ج: إضافة 40 وحدة من مثبط إنزيم RNase الفأري (NEB #M0314) أو مثبط إنزيم RNase المشيمي البشري (NEB #M0307) في درجة حرارة الغرفة يثبط إنزيم RNase 4 بفعالية بعد ظروف الهضم القياسية. بالنسبة للتطبيقات اللاحقة غير الحساسة للمنظفات أو عوامل الاستخلاب، فإن محلولًا من 0.2% (وزن/حجم) من كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) و20 ملي مولار من EDTA عند درجة حموضة 8.0 يعطل إنزيم RNase 4 تمامًا. س: هل نشاط إنزيم RNase 4 (NEB #M1284) الداخلي حساس لتعديلات الحمض النووي الريبي؟ ج: تم اختبار العديد من تعديلات اليوريدين، وأظهرت انخفاضًا طفيفًا أو معدومًا في نشاط إنزيم RNase 4، بما في ذلك أنواع اليوريدين الزائف، وN1-ميثيل-اليوريدين الزائف، و5-ميثوكسي، وثنائي هيدرويوريدين (Ψ، m1Ψ، mo5U، وD). لهضم الحمض النووي الريبي (RNA) الذي يحتوي على هذه التعديلات بكفاءة، وخاصة m1Ψ، نوصي بزيادة حجم إنزيم RNase 4 المضاف من 1 ميكرولتر إلى 3 ميكرولتر (50,000 وحدة/مل) في عمليات هضم مكافئة لـ 10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي. بما أن النشاط الإندونوكليازي لإنزيم RNase 4 يتطلب مجموعة الهيدروكسيل 2' في نيوكليوتيد اليوريدين، فإن تعديلات مثل 2'-O ميثيل يوريدين (Um) تثبط نشاط إنزيم RNase 4 تمامًا. س: هل يؤثر التركيب الثانوي للحمض النووي الريبي على نشاط إنزيم RNase 4 (NEB #M1288)؟ ج: للحصول على تغطية مثالية لرسم خرائط تسلسل النيوكليوتيدات، يُنصح بإجراء هضم RNase 4 في ظروف مُفسِخة للحد من التأثير المحتمل للبنية الثانوية للحمض النووي الريبي. يضمن تفاعل الهضم الذي يحتوي على تركيز نهائي لليوريا 1 مولار، مع حضانة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة، توفر معظم الحمض النووي الريبي للانقسام الداخلي. يتحمل نشاط إنزيم RNase 4 الداخلي للريبونوكلياز تركيزًا يصل إلى 3 مولار من اليوريا أو 50% من الفورماميد (حجم/حجم). يتحمل نشاط إصلاح نهايات بولينوكليوتيد كيناز T4 تركيزًا يصل إلى 3 مولار من اليوريا أو 25% من الفورماميد (حجم/حجم). س: هل يمكنك إخباري المزيد عن التحول من الألبومين البقري المصل (BSA) إلى الألبومين المؤتلف (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ ج: يسرّ شركة NEB أن تعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على BSA (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المُعاد تركيبه. ونعتقد أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونقدم هذا التحسين بنفس السعر. س: هل المغنيسيوم ضروري لنشاط RNase 4؟ ج: لا يحتاج RNase 4 إلى المغنيسيوم لنشاط الإندوريبونوكلياز.