نيو إنجلاند بيولابس، M1288L، مزيج هضم RNase 4 وإصلاح الطرف 3'

الفئات ذات الصلة: إنزيمات RNase، تعديل الحمض النووي الريبي، مواصفات شروط التفاعل : 1X NEBuffer™ r1.1، حضانة عند 37 درجة مئوية، 1X NEBuffer™ r1.1، 10 ملي مولار Bis-Tris-Propane-HCl، 10 ملي مولار MgCl2، 100 ميكروغرام/مل ألبومين معاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7 عند 25 درجة مئوية). الأسئلة الشائعة : س: ما مقدار مزيج هضم RNase 4 وإصلاح الطرف 3′ (NEB #M1288) الذي يجب استخدامه لهضم الحمض النووي الريبي لرسم خرائط تسلسل النيوكليوتيدات LC-MS/MS؟ أ: إضافة 1 ميكرولتر من مزيج هضم RNase 4 وإصلاح الطرف 3′ تُحقق أقصى تغطية تسلسلية لما يصل إلى 20 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي (RNA) غير المُعدَّل والمُستنسخ في المختبر، والذي يتراوح طوله بين 1000 و9000 نيوكليوتيد، في تفاعل حجمه 30 ميكرولتر (محلول NEBuffer r1.1 بتركيز 1X، ويوريا بتركيز 1 مولار) مُحضَّن عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. وكما هو الحال مع أنواع RNase الأخرى المُستخدمة في رسم خرائط التسلسل بتقنية LC-MS/MS، فإن كمية RNase 4 اللازمة لتحقيق أقصى تغطية تسلسلية تتطلب تحسينًا. عمومًا، يتطلب الحمض النووي الريبي (RNA) الأطول والأكثر تعديلًا إضافة كمية أكبر من مزيج هضم RNase 4 وإصلاح الطرف 3′ للحصول على أعلى تغطية تسلسلية. بالنسبة لركائز الحمض النووي الريبي (RNA) المُعدَّلة، نوصي أولًا بزيادة كمية مزيج هضم RNase 4 وإصلاح الطرف 3′ من 1 ميكرولتر إلى 3 ميكرولتر. س: هل يقوم إنزيم RNase 4 (NEB #M1284) بقطع الحمض النووي الريبوزي (RNA) في مواقع أخرى غير U/A و U/G؟ ج: يُفضل إنزيم RNase 4 عادةً المواقع التالية: U|A > U|G >>> C|A. ويُلاحظ انخفاض نشاط C|A عند وجود تركيزات عالية من إنزيم RNase 4 مقارنةً بالحمض النووي الريبوزي المستهدف. س: هل يُمكنني استخدام مزيج هضم RNase 4 وإصلاح الطرف 3′ (NEB #M1288) لتحليل غطاء 5′ للحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) الموجه بواسطة مسبار الحمض النووي؟ ج: نوصي بتخفيف إنزيم RNase 4 (NEB #M1284) في بروتوكولنا القياسي لتحليل غطاء 5′ للحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) الموجه بواسطة مسبار الحمض النووي. سيؤدي تطبيق هذا البروتوكول باستخدام مزيج هضم RNase 4 وإصلاح الطرف 3′ (NEB #M1288) إلى تخفيف متزامن لإنزيم T4 PNK، مما يُضعف كفاءة إصلاح الطرف 3′. لذا، نوصي حاليًا باستخدام إنزيم RNase 4 المستقل (NEB #M1284) لتحليل غطاء 5' mRNA الموجه بواسطة مسبار الحمض النووي. س: هل يمكن تعطيل إنزيم RNase 4 (NEB #M1284)؟ ج: إضافة 40 وحدة من مثبط RNase الفأري (NEB #M0314) أو مثبط RNase المشيمي البشري (NEB #M0307) في درجة حرارة الغرفة يثبط إنزيم RNase 4 بفعالية بعد ظروف الهضم القياسية. س: هل مزيج هضم RNase 4 وإصلاح الطرف 3' (NEB #M1288) حساس لتعديلات الحمض النووي الريبي؟ ج: تم اختبار العديد من تعديلات اليوريدين مع انخفاض طفيف في نشاط RNase 4 وT4 PNK 3'، بما في ذلك أنواع اليوريدين الزائف، وN1-ميثيل-زائف، و5-ميثوكسي، وثنائي هيدرويوريدين (ψ، m1ψ، mo5U، وD). لهضم الحمض النووي الريبوزي (RNA) الذي يحتوي على هذه التعديلات بكفاءة، وخاصةً m1ψ، نوصي بزيادة الحجم المضاف. بما أن نشاط إنزيم RNase 4 الداخلي يتطلب مجموعة الهيدروكسيل 2′ في نيوكليوتيد اليوريدين، فإن تعديلات مثل 2′-O ميثيل يوريدين (Um) في موقع الانقسام تثبط نشاط RNase 4 تمامًا. س: هل يؤثر التركيب الثانوي للحمض النووي الريبوزي على نشاط RNase 4 (NEB #M1288)؟ ج: للحصول على تغطية مثالية لرسم خرائط تسلسل النيوكليوتيدات، يُوصى بإجراء عمليات هضم RNase 4 في ظروف مُفسِخة للحد من التأثير المحتمل للتركيب الثانوي للحمض النووي الريبوزي. سيضمن تفاعل الهضم الذي يحتوي على تركيز نهائي لليوريا يبلغ 1 مولار، مع حضانة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة، أن يكون معظم الحمض النووي الريبوزي متاحًا للانقسام الداخلي. يتحمل نشاط إنزيم RNase 4 الداخلي للريبونوكلياز تركيزًا يصل إلى 3 مولار من اليوريا أو 50% من الفورماميد (حجم/حجم). يتحمل نشاط إصلاح نهايات الحمض النووي الريبوزي (RNA) بواسطة إنزيم T4 بولينوكليوتيد كيناز تركيزًا يصل إلى 3 مولار من اليوريا أو 25% من الفورماميد (حجم/حجم). س: هل يتطلب مزيج هضم الحمض النووي الريبوزي (RNA) وإصلاح النهاية 3′ بواسطة إنزيم RNase 4 (NEB #M1288) المغنيسيوم؟ ج: نوصي باستخدام محلول NEBuffer r1.1 المرفق لهضم الحمض النووي الريبوزي (RNA) باستخدام مزيج هضم الحمض النووي الريبوزي (RNA) وإصلاح النهاية 3′ بواسطة إنزيم RNase 4، وذلك باتباع بروتوكول الهضم الموصى به. يتطلب نشاط إصلاح النهاية 3′ بواسطة إنزيم T4 بولينوكليوتيد كيناز المغنيسيوم لإزالة الفوسفات بكفاءة. مع ذلك، تجدر الإشارة إلى أنه، كما هو الحال مع إنزيم RNase A، لا يتطلب إنزيم RNase 4 المغنيسيوم لنشاطه كإنزيم داخلي للريبونوكلياز. س: هل يمكنك إخباري المزيد عن التحول من الألبومين البقري (BSA) إلى الألبومين المؤتلف (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ يسرّ شركة NEB أن تعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على الألبومين البقري (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المُعاد تركيبه. ونعتقد أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونقدم هذا التحسين بنفس السعر.