مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، M1524S، TET2

الفئات ذات الصلة : إنزيمات تعديل القواعد، تحليل مثيلة الحمض النووي، إنزيمات تعديل الحمض النووي وتقنيات الاستنساخ. المواصفات: المواد المطلوبة ولكن غير المرفقة: مجموعة Monarch PCR وتنظيف الحمض النووي (NEB #T1130)، أو بروتينيز K غير المستقر حرارياً (NEB #P8111)، ماء خالٍ من النيوكلياز (NEB #B1500). تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لتعديل 1.4 بيكومول من جزيء أوليغونوكليوتيد مزدوج مكون من 21 قاعدة موسومة بالفلورة يحتوي على جزء CpG مثيل مركزي في حجم تفاعل إجمالي قدره 20 ميكرولتر في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. شروط التفاعل: محلول تفاعل TET2 بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. التعطيل الحراري: لا. شروط فحص الوحدة: يُحضن أوليغونوكليوتيد dsDNA موسوم بصبغة فلورية، يحتوي على 5mC واحد، مع وحدة واحدة من TET2 في محلول تفاعل TET2 بتركيز 1X (يحتوي على مكمل وFe2+). يجب أن تُعدّل وحدة واحدة من TET2 ما لا يقل عن 80% من 1.75 بيكومول من الركيزة، كما يُحدد بواسطة الفصل الكهربائي الشعيري. الأسئلة الشائعة : س: هل يمكن تعطيل TET2 (NEB #M1524) بالحرارة؟ ج: لا، لا يُعطل TET2 بسهولة بالحرارة. يمكن إزالة TET2 من التفاعل باستخدام عمود تنقية (مثل مجموعة Monarch® PCR & DNA Cleanup Kit، (NEB #T1130) أو بمعالجته ببروتينيز K غير المستقر حراريًا (NEB #P8111)). س: هل يمكن تخزين محلول الحديد الثنائي المخفف حديثًا لفترة طويلة؟ ج: لا. يجب التخلص من محلول الحديد الثنائي المخفف حديثًا فور استخدامه. س: هل يمكن تخزين مُكمِّل مُنظِّم تفاعل TET2 المُعاد تكوينه (المرفق مع NEB #M1524) لأكثر من 4 أشهر؟ ج: لا، يجب التخلص من مُكمِّل مُنظِّم تفاعل TET2 المُعاد تكوينه بعد 4 أشهر. يُوصى بتسجيل تاريخ إعادة التكوين على القارورة. س: هل يُظهر إنزيم TET2 (NEB #M1524) أي تفضيل لتسلسل معين؟ ج: نعم، قد يُظهر إنزيم TET2 بعض التفضيل لتسلسل معين، ولكن فقط عند تركيزات منخفضة من الإنزيم (على سبيل المثال، أعلى نشاط في سياق CpG مقارنةً بسياق CHH أو CHG). يمكن التغلب على تفضيلات التسلسل باستخدام 8 وحدات على الأقل (1 ميكرولتر من الإنزيم). س: ما هي مدة صلاحية مُكمِّل مُنظِّم تفاعل TET2 المُجفَّف بالتجميد (المُرفق مع NEB #M1524)؟ ج: عند درجة حرارة -20 درجة مئوية، يظل مُكمِّل مُنظِّم تفاعل TET2 المُجفَّف بالتجميد صالحًا للاستخدام لمدة تصل إلى عامين. مع ذلك، بعد إذابته في مُنظِّم تفاعل TET2 بتركيز 5X، يجب التخلص من مُكمِّل مُنظِّم تفاعل TET2 بعد 4 أشهر من التخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. س: هل من الطبيعي أن يكون لون محلول Fe(II) أصفر أو أن يُلاحظ تغير في اللون؟ ج: نعم، لوحظ تغير في اللون (من عديم اللون إلى أصفر). أظهرت الاختبارات عدم وجود فرق في الأداء بناءً على هذا التغير. س: هل إنزيم TET2 (NEB #M1524) نشط على الركائز المُثيلة بشكل غير متماثل؟ ج: نعم، حالة مثيلة السلسلة المُكمِّلة لا تؤثر على نشاط إنزيم TET2. س: هل إنزيم TET2 (NEB #M1524) نشط على الحمض النووي الريبي المُثيلي؟ س: هل يعمل إنزيم TET2 على الحمض النووي الريبي أحادي السلسلة أو ثنائي السلسلة؟ ج: لا، إنزيم TET2 غير نشط على الحمض النووي الريبي أحادي السلسلة أو ثنائي السلسلة. س: هل يعمل إنزيم TET2 (NEB #M1524) على الحمض النووي أحادي السلسلة المُمَثْيَل؟ ج: نعم، يعمل إنزيم TET2 على كلٍ من الحمض النووي أحادي السلسلة وثنائي السلسلة، مع تفضيل الحمض النووي ثنائي السلسلة. س: هل يُثبِّط EDTA نشاط إنزيم TET2 (NEB #M1524)؟ ج: نعم، يُثبِّط EDTA نشاط إنزيم TET2. نوصي بالحفاظ على تركيز EDTA أقل من 0.01 ملي مولار (نهائي) في تفاعل TET2. س: هل يُثبِّط الملح نشاط إنزيم TET2 (NEB #M1524)؟ ج: نعم، يُثبِّط الملح نشاط إنزيم TET2. نوصي بالحفاظ على تركيز الملح أقل من 50 ملي مولار (نهائي) في تفاعل TET2. س: ما هو نشاط إنزيم TET2 (NEB #M1524) في محاليل منظمة أخرى؟ ج: تم تصميم محلول تفاعل TET2 خصيصًا لتحقيق النشاط الأمثل لإنزيم TET2. لا يُنصح باستخدام محاليل منظمة أخرى مع TET2. س: ما هو نطاق درجة حرارة التفاعل لـ TET2 (NEB #M1524)؟ ج: يكون TET2 فعالاً عند درجات حرارة تتراوح بين 4 و60 درجة مئوية، وتُعدّ 37 درجة مئوية هي الدرجة المثلى.