نيو إنجلاند بيولابس، M1708L، WarmStart® Multi-Purpose LAMP/RT-LAMP 2X Master Mix (مع UDG)

الفئات ذات الصلة: التضخيم متساوي الحرارة وإزاحة السلسلة، تطبيقات الخلطات الرئيسية، مواصفات التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة ، المواد المطلوبة (غير متوفرة ): بادئات LAMP (نوصي باستخدام أداة تصميم بادئات LAMP من NEB)، عينات الحمض النووي المستهدفة، ماء عالي النقاء (H₂O) من الدرجة المستخدمة في البيولوجيا الجزيئية، كتلة تسخين، حمام مائي، مقياس تعكر فوري أو جهاز تدوير حراري (مع قياس الفلورة الفوري إذا رغبت في ذلك)، وأوعية تفاعل مناسبة للجهاز. الأسئلة الشائعة : س: ما هي درجة الحرارة المثلى لتضخيم LAMP/RT-LAMP؟ ج: نوصي بـ 65 درجة مئوية كدرجة حرارة ابتدائية لـ LAMP. ومع ذلك، من الممكن إجراء تفاعلات LAMP وRT-LAMP من 55 إلى 70 درجة مئوية، اعتمادًا على طبيعة مجموعة البادئات والأهداف. س: ما هو تركيز أيونات المغنيسيوم (Mg++) في الخلطة الرئيسية WarmStart LAMP/RT-LAMP؟ ج: يحتوي المزيج الرئيسي 2X على 16 ملي مول من كبريتات المغنيسيوم، وبالتالي 8 ملي مول من كبريتات المغنيسيوم في التفاعل النهائي 1X. س: ما أنواع عينات/مواد الإدخال المتوافقة مع مزيج LAMP/RT-LAMP؟ ج: تُعد تقنية LAMP عادةً تقنية قوية ومقاومة للمثبطات، ومزيج WarmStart® LAMP/RT-LAMP الرئيسي قادر على التضخيم المباشر باستخدام أنواع مختلفة من العينات. للحصول على أعلى دقة وحساسية، نوصي باستخدام حمض نووي نقي كمدخل. معظم طرق تنقية القوالب الروتينية كافية، مثل مجموعات استخلاص الأحماض النووية Monarch®. نقترح استخدام 2 ميكرولتر من الحمض النووي المستخلص لتفاعل LAMP بحجم 25 ميكرولتر. يمكن استخدام أحجام عينات أكبر أو أصغر. يجب ألا يتجاوز حجم العينات في وسط النقل (VTM أو UTM) 2 ميكرولتر (8% حجم/حجم). س: ما هي المدة المتوقعة لظهور النتيجة؟ ج: يختلف تضخيم الهدف تبعًا لعدة عوامل، منها تصميم البادئات (نوصي باستخدام أداة تصميم بادئات NEB LAMP)، ونقاء القالب وكميته. نقترح البدء بفترة حضانة 30 دقيقة. يمكن تقصير هذه الفترة إلى 15-20 دقيقة مع المقايسات المُحسّنة أو الأهداف ذات النسخ العالية، إذا رغبتم بذلك. كما يمكن إطالتها إلى 60 دقيقة للعينات ذات المدخلات المنخفضة، أو العينات غير النقية، أو المقايسات الأبطأ. يُرجى ملاحظة أنه عند إطالة وقت التفاعل، يجب مراقبة نتائج التحكم السلبية (NTCs) للتأكد من عدم وجود نتائج إيجابية خاطئة. س: هل يُمكنني تحضير تفاعلات LAMP/RT-LAMP في درجة حرارة الغرفة؟ ج: نعم، إن إنزيمات بوليميراز الحمض النووي Bst وإنزيم النسخ العكسي المستخدمة في هذا المزيج الرئيسي هي تركيبات WarmStart®، لذا فهي مُثبّطة بواسطة الأبتاميرات المُعدّلة في درجة حرارة الغرفة. وبالتالي، يُمكن تحضير التفاعلات في درجة حرارة الغرفة دون التأثير بشكل كبير على نشاط LAMP. للحصول على معلومات إضافية حول تعديل نشاط الإنزيم في درجة حرارة الغرفة باستخدام الأبتاميرات، يُرجى الاطلاع على "استخدام الأبتاميرات للتحكم في أنشطة الإنزيم: بدء تشغيل Taq الساخن وما بعده". س: يحتوي مزيج WarmStart LAMP Master Mix على بعض الرواسب في الأنبوب بعد إذابته، هل هذا طبيعي؟ ج: نعم، يُعد ترسب مزيج LAMP Master Mix بعد التجميد/الإذابة أمرًا طبيعيًا. من المهم إعادة تعليق المزيج عن طريق الخلط جيدًا أو استخدام جهاز الخلط الدوامي لإذابة جميع الرواسب، ولكن بعد التعليق، يمكن استخدام مزيج Master Mix كالمعتاد. س: كيف أصمم بادئات LAMP؟ ج: قد يكون تصميم بادئات LAMP يدويًا أمرًا صعبًا، ونوصي بشدة باستخدام برامج متخصصة لسهولة التصميم وزيادة احتمالية نجاح التفاعل. نوصي باستخدام أداة تصميم بادئات LAMP من NEB. نظرًا لأن الأداء ومستويات التضخيم غير المعتمد على القالب قد تختلف حتى مع التصميم الحاسوبي، نوصي بتقييم 2-4 مجموعات كاملة من بادئات LAMP للحصول على الحساسية والنوعية الأمثل قبل اختيار المجموعة النهائية. للحصول على نظرة عامة حول كيفية تصميم واستخدام بادئات LAMP، يُرجى مشاهدة البرنامج التعليمي الخاص بأداة تصميم بادئات LAMP، وقراءة هذه الملاحظة التطبيقية لمزيد من التفاصيل. س: هل يُمكّن مزيج WarmStart LAMP/RT-LAMP 2X Master Mix (مع UDG) من منع التلوث/تقليل التلوث المتبقي؟ ج: نعم، تم تركيب مزيج WarmStart LAMP/RT-LAMP 2X Master Mix (مع UDG) بمزيج من dTTP وdUTP. وهذا يضمن تضخيمًا متساوي الحرارة فعالًا بالإضافة إلى دمج dU في نواتج التفاعل. يحتوي المزيج أيضًا على UDG غير مستقر حراريًا في القطب الجنوبي (NEB #M0372). تعمل نواتج LAMP التي تحتوي على dU كركيزة لإنزيم يوراسيل دي إن إيه جليكوزيلاز، مما يسمح بمنع التلوث المتبقي. يجب تحضير التفاعلات في درجة حرارة الغرفة (عادةً 22-25 درجة مئوية) قبل الحضانة متساوية الحرارة للسماح بتحلل نواتج التضخيم المحتوية على dU، أو إذا رغبتم، يمكنكم حضانتها لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية قبل إضافة تفاعل LAMP إلى سير العمل. ولأن تفاعل LAMP يُنتج كميات كبيرة من الحمض النووي في فترات زمنية قصيرة جدًا، فإن أفضل الممارسات لتقليل التلوث تتضمن عدم فتح تفاعلات LAMP بعد التضخيم. س: حدث تضخيم في عينة (عينات) التحكم السلبية (NTC) بعد الحضانة متساوية الحرارة. ما السبب؟ ج: قد يشير التضخيم في عينة التحكم السلبية (بدون قالب) خلال 30 دقيقة إلى تلوث متبادل أثناء تحضير التفاعل أو إلى مشكلة عامة. بعض مجموعات البادئات أكثر عرضة للتضخيم غير النوعي من غيرها. نوصي بتقييم مجموعتين على الأقل من بادئات LAMP لأي هدف محدد. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون بعض صيغ التفاعل أو إجراءات العمل أكثر عرضةً للتضخيم غير النوعي مع مجموعات بادئات معينة، مثل: أحجام التفاعل الكبيرة في أوعية صغيرة (مثل 20 ميكرولتر في صفائح 384 بئرًا)، ودرجات حرارة التفاعل المنخفضة (مثل 60 درجة مئوية بدلًا من 65 درجة مئوية). عند استخدام جهاز التدوير الحراري في الوقت الحقيقي، يمكن تضمين منحنى الذوبان أو التمسخ بعد حضانة LAMP للتمييز بين التضخيم الزائف والتلوث المتبادل، حيث أن كل ناتج تضخيم LAMP سينتج عنه منحنى ذوبان فريد. إذا كانت نتيجة تفاعل NTC إيجابية عند إعادة الاختبار و/أو تغيير إجراءات العمل، فاستبدل جميع مخزونات الكواشف ونظف مساحة العمل بمطهر سطحي مناسب، مثل مبيض بنسبة 10% (تخفيف 1:10 من هيبوكلوريت الصوديوم التجاري بتركيز 5.25-6.0%). س: ما هي طرق الكشف التي يمكن استخدامها لتجارب LAMP/RT-LAMP؟ ج: يتوافق مزيج LAMP الرئيسي مع مجموعة متنوعة من خيارات التصوير/الكشف، بما في ذلك قياس العكارة، والتألق، والقياس اللوني غير المعتمد على الرقم الهيدروجيني (مثل أزرق هيدروكسي نافثول)، والطرق القائمة على الهلام. تأتي مجموعات LAMP (NEB #E1700 وNEB #E1708) مع صبغة فلورية LAMP بتركيز 50X ترتبط بالحمض النووي المزدوج (dsDNA) للكشف الفلوري في الوقت الحقيقي. س: ما هي مزايا استخدام LAMP القياسي (NEB #M1712، E1700، M1708) مقارنةً بـ LAMP اللوني المعتمد على الرقم الهيدروجيني (NEB #M1800، M1804)؟ ج: تستخدم مزيجات LAMP الرئيسية اللونية المعتمدة على الرقم الهيدروجيني (NEB #M1800، NEB #M1804) محلولًا ضعيف التنظيم للسماح بالكشف البصري باستخدام صبغة حساسة للرقم الهيدروجيني. تُعدّ هذه القراءة المرئية البسيطة مفيدةً للغاية لإجراء الاختبارات عند الحاجة. مع ذلك، فإنّ انخفاض سعة التخزين المؤقت اللازمة لتحفيز تغيير اللون من الوردي إلى الأصفر يحدّ من توافق العينات، إذ قد تؤثر مدخلات العينات ذات التخزين المؤقت العالي أو العينات الحمضية على تغيير اللون. تتحمّل الخلطات الرئيسية في منتجات LAMP القياسية لدينا (NEB #M1712، NEB #E1700، NEB #M1708) هذه الأنواع من مدخلات العينات بسهولة أكبر. كما تتوافق هذه المنتجات مع الكشف اللوني غير القائم على الرقم الهيدروجيني. تتيح الخلطات الرئيسية لتقنية LAMP/RT-LAMP من NEB خياراتٍ فيما يتعلق بنوع العينة وتغيير اللون المرئي. أما الخلطات الرئيسية لتقنية LAMP اللونية القائمة على الرقم الهيدروجيني من NEB، سواءً مع UDG (NEB #M1804) أو بدونه (NEB #M1800)، فهي ذات تخزين مؤقت ضعيف للسماح بالكشف المرئي عن التضخيم باستخدام الفينول الأحمر، وهو صبغة حساسة للرقم الهيدروجيني. تسمح السعة التخزينية المنخفضة بانخفاض درجة حموضة التفاعل مع إنتاج البروتونات من تضخيم الحمض النووي المستهدف، مما يُحدث تغيرًا في اللون من الوردي إلى الأصفر. تُعد هذه القراءة البصرية البسيطة مفيدةً للغاية للاختبارات عند الحاجة. مع ذلك، فإن السعة التخزينية المنخفضة المطلوبة للكشف القائم على درجة الحموضة تحد من توافق العينات مع مخاليط LAMP اللونية القائمة على درجة الحموضة. قد تُعيق مدخلات العينات ذات التخزينية العالية تغير اللون، بينما قد تُخفض العينات الحمضية درجة حموضة التفاعل بشكل كافٍ للتأثير على اللون الأولي. يتميز المزيج الرئيسي متعدد الأغراض LAMP/RT-LAMP 2X مع UDG (NEB #M1708، NEB #E1708) أو بدون UDG (NEB #E1700) بتخزينية كاملة، ويمكنه تحمل هذه الأنواع من مدخلات العينات بسهولة أكبر، مما يجعله متوافقًا مع الأصباغ اللونية الأخرى (مثل أزرق هيدروكسي نافثول، وهو مؤشر معدني). س: هل تتطلب تقنية RT-LAMP خطوة حضانة منفصلة؟ ج: لا داعي لخطوة النسخ العكسي المنفصلة لإجراء تفاعل RT-LAMP، حيث أن إنزيم النسخ العكسي WarmStart RTx يُنتج الحمض النووي التكميلي (cDNA) أثناء الحضانة متساوية الحرارة عند 65 درجة مئوية. س: ما نوع التنقية الموصى به لبادئات LAMP؟ ج: عند فحص مجموعات متعددة من بادئات LAMP لتحديد تلك ذات الأداء الأمثل لهدف معين، فإن إزالة الأملاح القياسية كافية عمومًا. مع ذلك، نوصي بتنقية بادئات FIP وBIP باستخدام الرحلان الكهربائي الهلامي متعدد الأكريلاميد (PAGE) أو كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء (HPLC) كحد أدنى للاختبار النهائي لضمان دقة النتائج من حيث وقت الكشف والحساسية.