نيو إنجلاند بيولابس، M1712L، Bst-XT WarmStart™ مزيج رئيسي متعدد الأغراض LAMP/RT-LAMP 2X (مع UDG)

الفئات ذات الصلة: التضخيم متساوي الحرارة وتطبيقات إزاحة السلسلة، التضخيم متساوي الحرارة، تضخيم الحمض النووي، تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR). المواصفات : المواد المطلوبة (غير المرفقة ): جهاز تسخين: كتلة تسخين، حمام مائي، أو مقياس فلوري في الوقت الحقيقي (جهاز qPCR) مضبوط على 65 درجة مئوية. الأسئلة الشائعة : س: ما هو تركيز أيونات المغنيسيوم (Mg++) في مزيج Bst-XT LAMP/RT-LAMP الرئيسي؟ ج: يحتوي المزيج الرئيسي بتركيز 2X على 14 ملي مول من كبريتات المغنيسيوم (MgSO4)، وبالتالي 7 ملي مول من كبريتات المغنيسيوم في التفاعل النهائي بتركيز 1X. س: ما هي درجة حرارة التضخيم المثلى لتفاعلات LAMP/RT-LAMP عند استخدام مزيج Bst-XT LAMP/RT-LAMP الرئيسي؟ ج: نوصي بإجراء تفاعلات LAMP عند 65 درجة مئوية. ومع ذلك، من الممكن إجراء تفاعلات LAMP وRT-LAMP عند درجات حرارة تتراوح بين 50 و70 درجة مئوية، وذلك حسب طبيعة مجموعة البادئات والهدف. س: هل يُمكّن مزيج Bst-XT WarmStart Multi-Purpose LAMP/RT-LAMP 2X Master Mix (مع UDG) من منع التلوث/تقليل التلوث المتبقي؟ ج: نعم، تم تركيب مزيج Bst-XT WarmStart Multi-Purpose LAMP/RT-LAMP 2X Master Mix (مع UDG) بمزيج من dTTP وdUTP. وهذا يضمن تضخيمًا متساوي الحرارة فعالًا، بالإضافة إلى دمج dU في نواتج التفاعل. يحتوي المزيج أيضًا على UDG غير مستقر حراريًا في القطب الجنوبي (NEB #M0372). في التفاعلات اللاحقة، تعمل نواتج LAMP التي تحتوي على dU كركيزة لـ UDG، وهو إنزيم جليكوزيلاز اليوراسيل DNA، مما يسمح بمنع التلوث المتبقي. سيقضي نشاط UDG أثناء التحضير بسرعة وكفاءة على أي نواتج ملوثة. نظرًا لأن LAMP يمكن أن يُنتج كميات كبيرة من الحمض النووي في فترات زمنية قصيرة جدًا، فإن أفضل الممارسات لتقليل التلوث تتضمن تجنب فتح تفاعلات LAMP بعد التضخيم. س: ما هي المدة المتوقعة لظهور النتائج عند استخدام مزيج Bst-XT LAMP/RT-LAMP الرئيسي؟ ج: يختلف تضخيم الهدف تبعًا لعدة عوامل، منها نقاء القالب وكميته وتصميم البادئات (نوصي باستخدام أداة تصميم بادئات NEB LAMP). نقترح البدء بفترة حضانة مدتها 20 دقيقة. يمكن تقصير هذه الفترة إلى 15 دقيقة في حال استخدام فحوصات مُحسّنة أو أهداف ذات عدد نسخ عالٍ. كما يمكن تمديدها إلى 40 دقيقة في حال استخدام كميات قليلة من المدخلات، أو عينات غير نقية، أو فحوصات أبطأ. يُرجى ملاحظة أنه عند تمديد وقت التفاعل، يجب مراقبة نتائج التحكم السلبية (NTCs) لضمان عدم حدوث نتائج إيجابية خاطئة. س: ما هي طرق الكشف المتوافقة مع مزيج Bst-XT LAMP/RT-LAMP الرئيسي؟ ج: يتوافق مزيج Bst-XT LAMP/RT-LAMP الرئيسي مع مجموعة متنوعة من طرق التصوير/الكشف، بما في ذلك التألق، والتعكر، والكشف اللوني النهائي باستخدام أصباغ معينة حساسة للمعادن (مثل الكالسئين مع المنغنيز أو إريوكروم بلاك تي). كما يتوافق هذا المزيج الرئيسي مع التقييم القائم على الهلام وطرق التدفق الجانبي. يُرجى ملاحظة أنه لا يُنصح باستخدام هيدروكسي نافثول الأزرق مع هذا المزيج الرئيسي لأن التغير اللوني الناتج غير واضح. في حال مراقبة التفاعل في الوقت الحقيقي، يمكن إضافة صبغة LAMP الفلورية (NEB #B1700) بتركيز نهائي 0.5X لمراقبة التفاعل في قناة SYBR/FAM لجهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي. يمكن معايرة الصبغة حسب الحاجة بين 0.1X و1X. س: ما هي مزايا استخدام اختبار LAMP القياسي (NEB #M1712، E1700، M1708، E1708) مقارنةً باختبار LAMP اللوني القائم على الرقم الهيدروجيني (NEB #M1800، M1804)؟ ج: تستخدم خلطاتنا الرئيسية لاختبار LAMP اللوني القائم على الرقم الهيدروجيني (NEB #M1800، NEB #M1804) محلولًا ضعيف التنظيم، مما يسمح بالكشف البصري باستخدام صبغة حساسة للرقم الهيدروجيني. تُعد هذه القراءة البصرية البسيطة مفيدةً للغاية للاختبارات السريعة. مع ذلك، فإن سعة التنظيم المنخفضة المطلوبة لتحفيز تغير اللون من الوردي إلى الأصفر تحد من توافق العينات، حيث قد تؤثر مدخلات العينات عالية التنظيم أو العينات الحمضية على تغير اللون. أما الخلطات الرئيسية في منتجاتنا القياسية لاختبار LAMP (NEB #M1712، NEB #E1700، NEB #M1708، NEB #E1708) فتتحمل هذه الأنواع من مدخلات العينات بسهولة أكبر. تتوافق هذه المنتجات أيضًا مع الكشف اللوني غير المعتمد على الرقم الهيدروجيني. تتيح الخلطات الرئيسية لتقنية LAMP/RT-LAMP من NEB خياراتٍ فيما يتعلق بنوع العينة والتغير اللوني المرئي. تتميز الخلطات الرئيسية لتقنية LAMP اللونية المعتمدة على الرقم الهيدروجيني من NEB، مع أو بدون إنزيم UDG (NEB #M1804)، بانخفاض قدرتها على التخزين المؤقت، مما يسمح بالكشف المرئي عن التضخيم باستخدام الفينول الأحمر، وهو صبغة حساسة للرقم الهيدروجيني. تسمح قدرة التخزين المؤقت المنخفضة بانخفاض الرقم الهيدروجيني للتفاعل مع إنتاج البروتونات من تضخيم الحمض النووي المستهدف، مما يُحدث تغيرًا في اللون من الوردي إلى الأصفر. يمكن أن تكون هذه القراءة المرئية البسيطة مفيدة بشكل خاص للاختبارات عند الحاجة. مع ذلك، فإن قدرة التخزين المؤقت المنخفضة المطلوبة للكشف المعتمد على الرقم الهيدروجيني تحد من توافق العينات مع خلطات LAMP اللونية المعتمدة على الرقم الهيدروجيني. قد تُعيق مدخلات العينات ذات التخزين المؤقت العالي التغير اللوني، بينما قد تُخفض العينات الحمضية الرقم الهيدروجيني للتفاعل بشكل كافٍ للتأثير على اللون الأولي. مزيج LAMP/RT-LAMP متعدد الأغراض بتركيز 2X مع UDG (NEB #M1708، NEB #E1708) أو بدون UDG (NEB #E1700) مُخفَّف بالكامل، ويتحمل بسهولة أكبر أنواع مدخلات العينات هذه، مما يجعله متوافقًا مع الأصباغ اللونية الأخرى (مثل أزرق هيدروكسي نافثول، وهو مؤشر معدني). س: هل يمكنني تحضير تفاعلات LAMP/RT-LAMP في درجة حرارة الغرفة؟ ج: نعم - إنزيمات بوليميراز الحمض النووي Bst وإنزيم النسخ العكسي المستخدمة في هذا المزيج الرئيسي هي تركيبات WarmStart®، لذا يتم تثبيطها بواسطة الأبتاميرات المعدلة في درجة حرارة الغرفة. وبناءً على ذلك، يمكن تحضير التفاعلات في درجة حرارة الغرفة دون التأثير بشكل كبير على نشاط LAMP. لمزيد من المعلومات حول تعديل نشاط الإنزيم في درجة حرارة الغرفة باستخدام الأبتاميرات، يُرجى الاطلاع على "استخدام الأبتاميرات للتحكم في أنشطة الإنزيم: Hot Start Taq وما بعده". س: كيف أصمم بادئات LAMP؟ ج: قد يكون تصميم بادئات LAMP يدويًا أمرًا صعبًا، لذا يُنصح بشدة باستخدام برامج متخصصة لسهولة التصميم وزيادة احتمالية نجاح التفاعل. نوصي باستخدام أداة تصميم بادئات LAMP من NEB. نظرًا لأن الأداء ومستويات التضخيم غير المعتمد على القالب قد تختلف حتى مع التصميم الحاسوبي، نوصي بتقييم 2-4 مجموعات كاملة من بادئات LAMP للحصول على أفضل حساسية ونوعية قبل اختيار المجموعة النهائية. للحصول على نظرة عامة حول كيفية تصميم بادئات LAMP واستخدامها، يُرجى مشاهدة البرنامج التعليمي لأداة تصميم بادئات LAMP، وقراءة هذه الملاحظة التطبيقية لمزيد من التفاصيل. س: حدث تضخيم في عينة (عينات) التحكم السلبي (NTC) بعد الحضانة متساوية الحرارة. ما السبب؟ ج: قد يشير التضخيم في عينة التحكم السلبي (NTC) خلال 30 دقيقة إلى تلوث متبادل أثناء إعداد التفاعل أو مشكلة عامة. بعض مجموعات البادئات أكثر عرضة للتضخيم غير النوعي من غيرها. نوصي بتقييم مجموعتين على الأقل من بادئات LAMP لأي هدف محدد. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون بعض صيغ التفاعل أو إجراءات العمل أكثر عرضةً للتضخيم غير النوعي مع مجموعات بادئات معينة، مثل: أحجام التفاعل الكبيرة في أوعية صغيرة (مثل 20 ميكرولتر في صفائح 384 بئرًا)، ودرجات حرارة التفاعل المنخفضة (مثل 60 درجة مئوية بدلًا من 65 درجة مئوية). عند استخدام جهاز التدوير الحراري في الوقت الحقيقي، يمكن تضمين منحنى الذوبان أو التمسخ بعد حضانة LAMP للتمييز بين التضخيم الزائف والتلوث المتبادل، حيث أن كل ناتج تضخيم LAMP سينتج عنه منحنى ذوبان فريد. إذا كانت نتيجة تفاعل NTC إيجابية عند إعادة الاختبار و/أو تغيير إجراءات العمل، فاستبدل جميع مخزونات الكواشف ونظف مساحة العمل بمطهر سطحي مناسب، مثل مبيض بنسبة 10% (تخفيف 1:10 من هيبوكلوريت الصوديوم التجاري بتركيز 5.25-6.0%). س: هل هناك حاجة إلى خطوة حضانة منفصلة لـ RT-LAMP؟ ج: لا داعي لخطوة النسخ العكسي المنفصلة لإجراء تفاعل RT-LAMP، حيث أن إنزيم النسخ العكسي WarmStart RTx يُنتج الحمض النووي التكميلي (cDNA) أثناء الحضانة متساوية الحرارة عند 65 درجة مئوية. س: ما نوع التنقية الموصى به لبادئات LAMP؟ ج: عند فحص مجموعات متعددة من بادئات LAMP لتحديد تلك ذات الأداء الأمثل لهدف معين، فإن إزالة الأملاح القياسية كافية بشكل عام. ومع ذلك، نوصي بتنقية بادئات FIP وBIP باستخدام PAGE أو HPLC كحد أدنى للاختبار النهائي لضمان دقة النتائج من حيث وقت الكشف والحساسية. س: يحتوي مزيج WarmStart LAMP الرئيسي على بعض الرواسب في الأنبوب بعد إذابته، هل هذا طبيعي؟ ج: نعم، ترسب مزيج LAMP الرئيسي بعد التجميد/الإذابة أمر طبيعي. من المهم إعادة تعليق المزيج عن طريق الخلط جيدًا أو استخدام جهاز الخلط الدوامي لإذابة جميع الرواسب، ولكن بعد التعليق، يمكن استخدام المزيج الرئيسي كالمعتاد.