نيو إنجلاند بيولابس، M1800S، WarmStart® Colorimetric LAMP 2X Master Mix (DNA & RNA)

حل بسيط بخطوة واحدة لتضخيم الحمض النووي DNA أو RNA بتقنية التضخيم المتساوي الحرارة بوساطة الحلقة (LAMP) (RT-LAMP). الفئات ذات الصلة: التضخيم المتساوي الحرارة وتطبيقات إزاحة السلسلة. التضخيم المتساوي الحرارة بوساطة الحلقة. الأسئلة الشائعة حول التضخيم المتساوي الحرارة: س: ما الفرق بين استخدام تفاعلات LAMP اللونية وتفاعلات LAMP العادية؟ ج: تعتمد تقنية LAMP اللونية الخاصة بنا، والقائمة على الرقم الهيدروجيني، على نفس مبدأ تضخيم LAMP وRT-LAMP، ولكنها مصممة للسماح بالكشف البصري عن التفاعلات الإيجابية. تحتوي خلطات WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mixes على صبغة الفينول الأحمر الحساسة للرقم الهيدروجيني في محلول تفاعل منخفض التركيز، يتغير لونه من الوردي الفاتح إلى الأصفر عند تضخيم الحمض النووي DNA (نتيجة إطلاق بروتون لكل نيوكليوتيد مُدمج). يتيح هذا الكشف استخدام معدات بسيطة (مثل الماء الساخن للحضانة، والكشف البصري) بدلاً من الأجهزة المعقدة والمكلفة لتفاعلات LAMP. س: ما هي المدة اللازمة لحضانة تفاعل LAMP اللوني قبل التحقق من النتائج؟ ج: نوصي بحضانة تفاعل LAMP اللوني لمدة 30 دقيقة. عند هذه المدة، ستتغير ألوان معظم تفاعلات LAMP الإيجابية، وستكون نتائج عينات التحكم السلبية (بدون قالب) سلبية. يمكن تقليل المدة إلى 15-20 دقيقة في حال استخدام فحوصات جيدة أو أهداف ذات عدد نسخ عالٍ، أو إطالتها إلى 60 دقيقة في حال استخدام مدخلات منخفضة جدًا، أو عينات غير نقية، أو فحوصات أبطأ. عند تحسين وقت التفاعل، يمكن التحقق من تقدمه ببساطة من خلال ملاحظة ألوان التفاعل، وإطالة مدة الحضانة في حال عدم اكتماله. تجدر الإشارة إلى أنه عند إطالة وقت التفاعل، يجب أيضًا مراقبة عينات التحكم السلبية (NTC) للتأكد من عدم وجود نتائج إيجابية خاطئة. س: ما هي مكونات مزيج WarmStart® Colorimetric LAMP 2X Master Mix، وماذا أحتاج أيضًا لإجراء تفاعل LAMP؟ ج: يحتوي مزيج WarmStart Colorimetric 2X Master Mix على محلول منظم منخفض Tris مع جميع العوامل المساعدة اللازمة بتركيزات مُحسّنة 2X لتفاعل LAMP، بما في ذلك بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0 WarmStart®، وWarmStart RTx، والفينول الأحمر للكشف عن درجة الحموضة في تفاعل LAMP. لإجراء تفاعل LAMP أو RT-LAMP، أضف البادئات، والحمض النووي المستهدف (DNA أو RNA)، واضبط حجم التفاعل الكلي إلى تركيز نهائي 1X. تجد التعليمات التفصيلية في البروتوكول. س: ما هو تركيز أيونات المغنيسيوم (Mg++) في مزيج Colorimetric LAMP 2X Master Mix؟ ج: يحتوي المزيج 2X على 16.0 ملي مولار من كبريتات المغنيسيوم (MgSO4)، وبالتالي 8.0 ملي مولار من كبريتات المغنيسيوم في التفاعل النهائي 1X. س: هل يمكن استخدام مزيج Colorimetric LAMP 2X Master Mix في الأجهزة التي تستخدم الكشف الفلوري لتضخيم الحمض النووي أو قياس العكارة في الوقت الحقيقي؟ ج: يتوافق المزيج الرئيسي مع طرق الكشف الفلوري عند إضافة أصباغ فلورية تتداخل مع الحمض النووي، ويُعطي سرعة تفاعل مماثلة لتقنية LAMP التقليدية. كما يُمكن إجراء الكشف بتقنية LAMP باستخدام مقياس التعكر في الوقت الحقيقي، على الرغم من أن سرعة التفاعل أبطأ قليلاً من سرعة تفاعل تقنية LAMP التقليدية. س: كيف أصمم بادئات LAMP؟ ج: قد يكون تصميم بادئات LAMP يدويًا أمرًا صعبًا، لذا يُنصح بشدة باستخدام برامج متخصصة لسهولة التصميم وزيادة احتمالية نجاح التفاعل. نوصي باستخدام أداة تصميم بادئات LAMP من NEB. نظرًا لأن الأداء ومستويات التضخيم غير المعتمد على القالب قد تختلف حتى مع التصميم الحاسوبي، نوصي بتقييم 2-4 مجموعات كاملة من بادئات LAMP للحصول على أفضل حساسية ونوعية قبل اختيار المجموعة النهائية. للحصول على نظرة عامة حول كيفية تصميم بادئات LAMP واستخدامها، يُرجى مشاهدة البرنامج التعليمي لأداة تصميم بادئات LAMP، وقراءة هذه الملاحظة التطبيقية لمزيد من التفاصيل. س: يحتوي المزيج الرئيسي WarmStart LAMP على بعض الرواسب في الأنبوب بعد إذابته، هل هذا طبيعي؟ ج: نعم، يُعدّ ترسب مزيج LAMP الرئيسي بعد التجميد/الإذابة أمرًا طبيعيًا. من المهم إعادة تعليق المزيج عن طريق الخلط الجيد أو استخدام جهاز الخلط الدوامي لإذابة جميع المواد المترسبة، ولكن بعد التعليق، يمكن استخدام المزيج الرئيسي كالمعتاد. س: ما مدى استقرار مزيج WarmStart Colorimetric LAMP 2X الرئيسي؟ ج: مزيج LAMP اللوني مستقر في ظل ظروف المناولة والاستخدام القياسية. يحتوي على تركيز منخفض من Tris pH 8، ويُظهر الفينول الأحمر الحساس للأس الهيدروجيني لونًا ورديًا زاهيًا بالقرب من هذا الأس الهيدروجيني. بعد الاستخدام المتكرر لنفس الأنبوب، من الممكن حدوث انخفاض طفيف في الأس الهيدروجيني، ولكنه عادةً لا يؤثر على أداء التفاعل بشرط أن يظل المزيج ورديًا قبل التضخيم. في بعض الأحيان، بعد استخدامات متعددة وتعرض مطول للهواء، قد ينخفض ​​الأس الهيدروجيني إلى أقل من 7، وسيتحول لون المزيج إلى برتقالي فاتح أو أصفر قبل الاستخدام. يوفر هذا التغير اللوني مؤشرًا مرئيًا على أن المحلول لم يعد مناسبًا لتفاعل LAMP اللوني. لذا يُنصح بتجنب تعريض المزيج الرئيسي للهواء لفترات طويلة عن طريق إغلاق أغطية الأنابيب بإحكام وتخزينه في القارورة الأصلية (أو في قوارير مماثلة مزودة بحلقات مانعة للتسرب) عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. في حال استخدام الماصة لنقل المزيج الرئيسي إلى أنابيب الشرائح أو أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أو ما شابه، يُنصح باستخدامه في نفس اليوم. س: ما هو المحلول المنظم الذي يجب استخدامه لعينات الهدف والبادئات المستخدمة في تفاعل LAMP اللوني؟ ج: نوصي بإذابة أو تخفيف الحمض النووي المستهدف (DNA أو RNA) في الماء، وإضافة 1-5 ميكرولتر إلى حجم تفاعلات LAMP البالغ 25 ميكرولتر. يمكن استخدام محلول TE المنظم (10 ملي مولار Tris، 1.0 ملي مولار EDTA، درجة الحموضة 7.5-8.0)، ولكن يجب ألا تتجاوز كمية الهدف المذاب في محلول TE 1-2 ميكرولتر (أو أقل من 10% من الحجم النهائي). وبالمثل، يجب ألا تتجاوز أي عينة مخزنة في محلول قلوي (درجة حموضة أعلى من 8.5) أو حمضي (درجة حموضة أقل من 7) 10% من حجم التفاعل النهائي، حيث أن زيادة الكمية قد تؤثر على الكشف القائم على درجة الحموضة. إذا كانت هناك حاجة إلى أكثر من 5 ميكرولتر للحصول على عدد نسخ كافٍ، فاستخدم الماء أو محلولًا مخففًا بنسبة 0.1X من محلول العينة. س: ما هي مكونات مزيج WarmStart® Colorimetric LAMP Master Mix، وماذا أحتاج أيضًا لإجراء تفاعل LAMP؟ ج: يحتوي مزيج WarmStart Colorimetric Master Mix على محلول تفاعل منخفض Tris مع جميع العوامل المساعدة اللازمة بتركيزات مُحسَّنة 2X لتفاعل LAMP، وبوليميراز الحمض النووي Bst 2.0 WarmStart®، وWarmStart RTx، وفينول أحمر للكشف عن درجة حموضة تفاعل LAMP. لإجراء تفاعل LAMP أو RT-LAMP، يضيف المستخدم البادئات، والحمض النووي المستهدف (DNA أو RNA)، ويضبط التركيز النهائي إلى 1X. يمكن الاطلاع على التعليمات التفصيلية في البروتوكول. س: ما الفرق بين مزيج WarmStart® Colorimetric LAMP 2X Master Mix مع UDG (NEB #M1804) ومزيج WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix (DNA & RNA) (NEB #M1800)؟ ج: يحتوي كلا مزيجَي WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix على صبغة حساسة للأس الهيدروجيني في محلول تفاعل منخفض التركيز، يتغير لونها من الوردي الفاتح إلى الأصفر عند تضخيم الحمض النووي. يتيح هذا الكشف البصري البسيط، بالإضافة إلى حضانة بدرجة حرارة واحدة، استخدام معدات أقل تعقيدًا (مثل أجهزة التسخين والحاضنات) مقارنةً بتفاعلات LAMP التقليدية. يُعدّ مزيج WarmStart® Colorimetric LAMP 2X Master Mix مع UDG نسخةً مُعدّلة من M1800، حيث يحتوي على dUTP و UDG غير المستقر حراريًا في القطب الجنوبي (NEB #M0372)، مما يمنع تضخيم نواتج التفاعل السابقة التي تحتوي على اليوراسيل. تقلل هذه الإضافات من احتمالية التلوث المتبقي (حيث يمكن أن يعمل ناتج تفاعل سابق بشكل غير متوقع كركيزة لتفاعل لاحق). يحتوي كلا المزيجين على WarmStart Bst 2.0® وWarmStart RTx، ويمكن استخدامهما لتضخيم كل من الحمض النووي الريبي (RNA) والحمض النووي (DNA/cDNA). س: ماذا لو كان مزيج LAMP اللوني برتقاليًا بدلًا من وردي قبل التضخيم؟ ج: مزيج LAMP اللوني مستقر في ظل ظروف المناولة والاستخدام القياسية. يحتوي على تركيز منخفض من Tris pH 8، ويظهر الفينول الأحمر الحساس للأس الهيدروجيني لونًا ورديًا زاهيًا بالقرب من هذا الأس الهيدروجيني. بعد الاستخدام المتكرر لنفس الأنبوب، من الممكن حدوث انخفاض طفيف في الأس الهيدروجيني، ولكنه عادةً لا يؤثر على أداء التفاعل طالما أن المزيج لا يزال ورديًا قبل التضخيم. في بعض الأحيان، بعد استخدامات متعددة وتعرض مطول للهواء، قد ينخفض ​​الأس الهيدروجيني إلى أقل من 7، وسيتحول لون المزيج إلى برتقالي فاتح أو أصفر قبل الاستخدام. يوفر هذا التغير اللوني مؤشرًا مرئيًا على أن المحلول لم يعد مناسبًا لتفاعل LAMP اللوني. لذا يُنصح بتجنب تعريض المزيج الرئيسي للهواء لفترات طويلة عن طريق إغلاق أغطية الأنابيب بإحكام وتخزينه في القارورة الأصلية (أو في قوارير مماثلة مزودة بحلقات مانعة للتسرب) عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. في حال استخدام الماصة لنقل المزيج الرئيسي إلى أنابيب الشرائح أو أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أو ما شابه، يُنصح باستخدامه في نفس اليوم. س: هل يُنصح باستخدام غوانيدين هيدروكلوريد (B2619A) في تفاعلات LAMP اللونية؟ ج: نوصي بأن تحتوي تفاعلات LAMP اللونية على تركيز نهائي قدره 40 ملي مولار من غوانيدين هيدروكلوريد، وبالتالي توفيره لإضافته إلى تفاعل LAMP في سير العمل القياسي لفيروس SARS-CoV-2. مع ذلك، قد تُدخل بعض إجراءات تحضير العينات الأولية مصدرًا للغوانيدين إلى العينة، والذي يمكن أن ينتقل إلى تفاعل LAMP. في حال انتقال الغوانيدين إلى التفاعل مع المادة المُدخلة، نوصي بعدم تجاوز تركيزه 60 ملي مولار في التفاعل النهائي، واستبدال الحجم المخصص لغوانيدين هيدروكلوريد بماء خالٍ من النيوكلياز. يعزز الغوانيدين التضخيم المتساوي الحرارة، مما يؤدي إلى كشف أسرع لحمض الريبونوكلييك (RNA) لفيروس SARS-CoV-2. أُجري تفاعل التضخيم المتساوي الحرارة اللوني (LAMP) باستخدام عينات موجبة مُنقّاة (10 نانوغرام/ميكرولتر من الحمض النووي الريبوزي البشري الكلي + حمض الريبونوكلييك الاصطناعي لفيروس SARS-CoV-2 بتركيز 10000 نسخة لكل تفاعل). استُخدمت مجموعات البادئات E1 أو N2 من مجموعة أدوات فحص LAMP اللوني السريع لفيروس SARS-CoV-2 كما هو موضح، ورُصد التضخيم في الوقت الحقيقي باستخدام صبغة فلورية. بالنسبة لكلا مجموعتي البادئات، أدى إضافة هيدروكلوريد الغوانيدين إلى تركيز نهائي يتراوح بين 40 و60 ملي مولار إلى تعزيز التضخيم، مما أدى إلى كشف مبكر وتغير لوني ملحوظ. س: ما حجم العينة الذي يمكن إضافته إلى تفاعل LAMP اللوني كمدخل؟ ج: للحصول على أفضل النتائج، نوصي باستخدام 2 ميكرولتر من الحمض النووي المستخلص في تفاعل حجمه 25 ميكرولتر. يمكن استخدام أحجام أكبر أو أصغر من العينات. تأكد من استخلاص الحمض النووي أو تحضيره في الماء لتجنب انتقال كمية زائدة من المحلول المنظم إلى التفاعل. يجب ألا يتجاوز حجم المادة المستخلصة في محلول TE أو محلول استخلاص مشابه 5 ميكرولتر (20% حجم/حجم) من حجم التفاعل النهائي. أما العينات في وسط النقل (VTM أو UTM) فيجب ألا يتجاوز حجمها 2 ميكرولتر (8% حجم/حجم). لزيادة حجم العينة، استخدم محلول استخلاص بتركيز 0.1X أو الماء لتحضير الحمض النووي. س: هل يمكنني مراقبة تغير لون تفاعلات LAMP اللونية باستخدام مطياف ضوئي؟ ج: نعم. يمكن مراقبة التفاعل في الوقت الفعلي أو عند نقطة النهاية كجزء من سير عمل عالي الإنتاجية عن طريق قياس نسبة الامتصاص عند 432 نانومتر/560 نانومتر. س: هل يمكن استخدام مزيج WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mixes في الأجهزة التي تستخدم الكشف الفلوري؟ ج: يتوافق المزيج الرئيسي اللوني مع طرق الكشف الفلوري عند إضافة أصباغ فلورية تتداخل مع الحمض النووي (SYTO 9 أو ما شابه)، ويُعطي سرعات تفاعل مماثلة لتقنية LAMP التقليدية. مع ذلك، نوصي باستخدام منتجات LAMP القياسية لدينا (NEB #E1700، E1708) عندما تكون القراءة الأساسية هي الفلورة. س: ما هي درجة حرارة التضخيم المثلى لتقنية LAMP/RT-LAMP؟ ج: نوصي بـ 65 درجة مئوية كدرجة حرارة ابتدائية لتقنية LAMP. مع ذلك، من الممكن إجراء تفاعلات LAMP وRT-LAMP عند درجات حرارة تتراوح بين 55 و70 درجة مئوية، وذلك حسب طبيعة مجموعة البادئات والأهداف. س: ما هي السرعة المتوقعة للحصول على النتيجة؟ ج: يختلف تضخيم الهدف تبعًا لعدد من العوامل، بما في ذلك تصميم البادئات (نوصي باستخدام أداة تصميم بادئات LAMP من NEB)، ونقاء القالب وكميته. نقترح البدء بفترة حضانة مدتها 30 دقيقة. إذا رغبت، يمكن تقصير وقت التفاعل إلى 15-20 دقيقة باستخدام فحوصات مُحسّنة أو أهداف ذات نسخ عالية. بدلاً من ذلك، يمكن إطالته إلى 60 دقيقة للعينات ذات المدخلات المنخفضة، أو العينات غير النقية، أو الفحوصات الأبطأ. يُرجى ملاحظة أنه عند إطالة وقت التفاعل، يجب أيضًا مراقبة عينات التحكم السلبية (NTCs) للتأكد من عدم وجود نتائج إيجابية خاطئة. س: هل يُمكنني إجراء تفاعلات LAMP/RT-LAMP في درجة حرارة الغرفة؟ ج: نعم - إنزيمات بوليميراز الحمض النووي Bst وإنزيم النسخ العكسي المستخدمة في هذا المزيج الرئيسي هي تركيبات WarmStart®، لذا يتم تثبيطها بواسطة الأبتاميرات المُعدّلة في درجة حرارة الغرفة. وبناءً على ذلك، يُمكن تحضير التفاعلات في درجة حرارة الغرفة دون التأثير بشكل كبير على نشاط LAMP. لمزيد من المعلومات حول تعديل نشاط الإنزيم في درجة حرارة الغرفة باستخدام الأبتاميرات، يُرجى الاطلاع على "استخدام الأبتاميرات للتحكم في أنشطة الإنزيم: Hot Start Taq وما بعده". س: حدث تضخيم في عينة (عينات) التحكم السلبية (NTC) بعد الحضانة متساوية الحرارة. ما الذي حدث؟ أ: قد يشير التضخيم في عينة التحكم السلبية (بدون قالب) خلال 30 دقيقة إلى تلوث متبادل أثناء تحضير التفاعل أو إلى مشكلة عامة. بعض مجموعات البادئات أكثر عرضة للتضخيم غير النوعي من غيرها. نوصي بتقييم مجموعتين على الأقل من بادئات LAMP لأي هدف محدد. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون بعض صيغ التفاعل أو إجراءات العمل أكثر عرضة للتضخيم غير النوعي مع مجموعات بادئات معينة، مثل: أحجام تفاعل كبيرة في أوعية صغيرة (مثل 20 ميكرولتر في صفائح 384 بئرًا)، ودرجات حرارة تفاعل منخفضة (مثل 60 درجة مئوية بدلًا من 65 درجة مئوية). في حال استخدام جهاز تدوير حراري فوري، يمكن تضمين منحنى الذوبان أو التمسخ بعد حضانة LAMP للتمييز بين التضخيم العشوائي والتلوث المتبادل، حيث أن كل ناتج تضخيم LAMP سينتج عنه منحنى ذوبان فريد. إذا كانت نتيجة تفاعل NTC إيجابية عند إعادة الاختبار أو عند تغيير سير العمل، فاستبدل جميع محاليل الكواشف ونظف سطح العمل بمطهر مناسب، مثل محلول مبيض بنسبة 10% (مخفف بنسبة 1:10 من محلول هيبوكلوريت الصوديوم التجاري بتركيز 5.25-6.0%). س: هل يلزم إجراء خطوة حضانة منفصلة لتقنية RT-LAMP؟ ج: لا يلزم إجراء خطوة نسخ عكسي منفصلة لإجراء تقنية RT-LAMP، حيث ينتج إنزيم النسخ العكسي WarmStart RTx الحمض النووي التكميلي (cDNA) أثناء الحضانة متساوية الحرارة عند 65 درجة مئوية. س: هل لدى NEB مزيج رئيسي لتفاعلات LAMP أو RT-LAMP؟ ج: نعم. نوفر عدة خيارات لدعم بروتوكولات LAMP/RT-LAMP. تتضمن مجموعة WarmStart® LAMP (DNA وRNA) (NEB #E1700) صبغة فلورية LAMP بتركيز 50X لدعم الكشف الفلوري عن تفاعلات LAMP/RT-LAMP. يحتوي مزيج WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix (DNA & RNA) (NEB #M1800) على مؤشر لوني يعتمد على الرقم الهيدروجيني للكشف البصري عن تفاعلات LAMP/RT-LAMP (يشير تغير اللون من الوردي إلى الأصفر إلى التضخيم). تتضمن الإصدارات المُحدثة من كلا المنتجين إنزيم UDG وdUTP غير المستقرين حراريًا لتقليل خطر التلوث المتبقي (NEB #E1708 وNEB #M1804 على التوالي). بالإضافة إلى ذلك، يتوافق مزيج WarmStart Multi-Purpose LAMP/RT-LAMP 2X Master Mix (مع UDG) (NEB #M1708) مع أنواع مختلفة من عينات الإدخال ويدعم طرق كشف متعددة، بما في ذلك هيدروكسي نافثول الأزرق. تحتوي جميع مزيجات LAMP الرئيسية على مزيج من إنزيم النسخ العكسي WarmStart RTx وإنزيم بوليميراز الحمض النووي WarmStart Bst 2.0 لتضخيم سريع وفعال من كل من أهداف الحمض النووي DNA والحمض النووي الريبي RNA. لا يتطلب كل مزيج سوى بادئات LAMP التي يوفرها المستخدم وعينات الحمض النووي المستهدف (DNA أو RNA). س: ما هي تقنية LAMP وRT-LAMP؟ ج: التضخيم المتساوي الحرارة بوساطة الحلقة (LAMP) هي طريقة تضخيم متساوية الحرارة مصممة للكشف عن الحمض النووي المستهدف دون الحاجة إلى معدات معقدة. تستخدم هذه التقنية بوليميراز DNA مُزيح للسلسلة، مثل بوليميراز Bst DNA، و4-6 بادئات تتعرف على 6-8 مناطق مميزة من الحمض النووي المستهدف لإجراء تفاعل تضخيم عالي التخصص. توفر تقنية LAMP حساسية عالية (تصل إلى فيمتوغرام أو أقل من 10 نسخ من الهدف) مع نتائج سريعة: يمكن إجراء التفاعلات في غضون 5-10 دقائق فقط. يمكن إجراء التفاعلات بموارد محدودة، باستخدام حمام مائي للحضانة والكشف عن النتائج بالعين المجردة، أو باستخدام القياس في الوقت الحقيقي وأجهزة عالية الإنتاجية. يتم الكشف عن أهداف RNA بإضافة بسيطة لإنزيم النسخ العكسي إلى تفاعل LAMP، بينما يتم إجراء RT-LAMP كعملية متساوية الحرارة من خطوة واحدة. إنزيم النسخ العكسي WarmStart RTx (NEB #M0380) هو بوليميراز DNA موجه بالحمض النووي الريبي (RNA) مرتبط بأبتامر قابل للانعكاس، مما يثبط نشاط RTx عند درجة حرارة أقل من 40 درجة مئوية، وهو ما يجعله مناسبًا بشكل خاص لتقنية RT-LAMP. لمعرفة المزيد والاطلاع على منتجاتنا الخاصة بتقنية LAMP، يرجى زيارة صفحة نظرة عامة على تطبيقات LAMP. س: ما نوع التنقية الموصى به لبادئات LAMP؟ ج: عند فحص مجموعات متعددة من بادئات LAMP لتحديد تلك ذات الأداء الأمثل لهدف معين، فإن إزالة الأملاح القياسية كافية بشكل عام. ومع ذلك، نوصي بتنقية بادئات FIP وBIP باستخدام PAGE أو HPLC كحد أدنى للاختبار النهائي لضمان دقة النتائج من حيث وقت الكشف والحساسية.