نيو إنجلاند بيولابس، M2081L، إنزيم تغطية فيروس فاوستوفيروس

الفئات ذات الصلة: مواصفات تغطية الحمض النووي الريبي (RNA) | تعريف الوحدة: تُعرَّف وحدة واحدة من إنزيم تغطية فيروس فاوستو بأنها كمية الإنزيم اللازمة لتحويل 75 بيكومول من حمض نووي ريبي ppp-RNA مكون من 20 قاعدة إلى حمض نووي ريبي Cap-0 خلال 30 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. شروط التفاعل: محلول التغطية 1X، مُضاف إليه 0.5 ملي مولار من GTP و0.1 ملي مولار من S-أدينوسيل ميثيونين (SAM)، يُحضن عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. محلول التغطية 1X: 50 ملي مولار Tris-HCl، 5 ملي مولار KCl، 1 ملي مولار MgCl2، 1 ملي مولار DTT (الأس الهيدروجيني 8 عند 25 درجة مئوية). التثبيط الحراري: 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. يُوصى بإضافة EDTA بتركيز 5 ملي مولار لتجنب تحلل الحمض النووي الريبي. الأسئلة الشائعة : س: ما هما Cap-0 وCap-1؟ ج: يُعرف غطاء 0، أو غطاء m7G أو m7GpppN (حيث يرمز N إلى أي نيوكليوتيد ريبوزي)، بأنه غوانوزين N7-ميثيل مرتبط برابطة ثلاثية الفوسفات من الطرف 5′ إلى الطرف 5′ من النسخة. يتطلب بدء الترجمة المعتمد على الغطاء، وهو الآلية الأساسية لبدء الترجمة في حقيقيات النوى، بنية غطاء 0. يؤدي مثيلة 2′-O في الموضع الأول بعد نيوكليوتيد غطاء 0 إلى تكوين غطاء 1، والذي يمكن تمثيله أيضًا بـ m7GpppNm-. وقد ثبت أن غطاء 1 يمنع التنشيط غير المناسب لمستقبلات المناعة الفطرية المضادة للفيروسات بواسطة النسخ الداخلية في الجسم الحي. س: هل يمكن لإنزيم غطاء فيروس فاوستو (NEB #M2081) استخدام نظائر الغطاء في تفاعل الغطاء؟ ج: لا. يستخدم إنزيم تغطية فيروس فاوستو جزيئي GTP وSAM لتكوين بنية غطاء على الحمض النووي الريبي ثلاثي الفوسفات 5′، وهو عادةً نسخة اصطناعية مُولَّدة عن طريق النسخ المختبري. تُدمج نظائر الغطاء، مثل GpppG (NEB #S1407) وm7GpppG (NEB #S1404) وm7GpppA (NEB #S1405S) ونظير الغطاء العكسي المضاد (ARCA؛ NEB #S1411)، مباشرةً في النسخة بواسطة بوليميراز الحمض النووي الريبي كأول نيوكليوتيد في الطرف 5′. س: هل يمكن لإنزيم تغطية فيروس فاوستو (NEB #M2081) استخدام نظائر GTP في تفاعل التغطية؟ ج: يتم دمج نظائر GTP المعدلة عند الطرف 3′، مثل 3′-بيوتين-GTP (NEB #N0760S) و3′-ديسثيوبيوتين-GTP (NEB #N0761S)، بشكل ضعيف فقط بواسطة إنزيم التغطية الخاص بفيروس فاوستو. نوصي باستخدام إنزيم التغطية الخاص بفيروس الوقس (NEB #M2080) في هذه الحالة. س: هل إنزيم التغطية الخاص بفيروس فاوستو حساس للبنية الثانوية؟ ج: نعم. البنى الثانوية التي تحد من إمكانية الوصول إلى الطرف 5′ تقلل من كفاءة التغطية. يمكن تحسين تغطية الركائز ذات البنية المعقدة عن طريق حضانة تفاعلات التغطية في درجات حرارة أعلى أو تسخين العينة مسبقًا قبل إضافة إنزيم التغطية. في الحالات الشديدة، قد يكون من الضروري تغيير تسلسل النسخة لتقليل البنية الثانوية. س: هل إنزيم التغطية الخاص بفيروس فاوستو نشط في درجات حرارة أخرى غير 37 درجة مئوية؟ ج: يحافظ إنزيم التغطية الخاص بفيروس فاوستو على نشاط تغطية شبه مثالي حتى 50 درجة مئوية. يقل نشاط التغطية عند درجات حرارة أقل من 37 درجة مئوية، على الرغم من ملاحظة نشاط أكبر مع FCE مقارنة بـ VCE عند نفس التركيزات المولية.