مجموعة الربط السريع M2200S من شركة نيو إنجلاند بيولابس

هل تبحث عن تركيبات وأنواع إضافية من إنزيم ربط الحمض النووي T4؟ الفئات ذات الصلة: تطبيقات إنزيمات ربط الحمض النووي، الاستنساخ، الربط، الاستنساخ السريع: سرّع عمليات الاستنساخ باستخدام كواشف من NEB. المواصفات: المواد المطلوبة (غير متوفرة ): ماء خالٍ من النيوكلياز (NEB #B1500). الأسئلة الشائعة : س: ما العوامل التي قد تؤدي إلى عدم اكتمال الربط و/أو التحويل باستخدام مجموعة الربط السريع؟ ج: الأسباب الأكثر ترجيحًا هي: أ. تم تعطيل تفاعل الربط السريع بالحرارة. يؤدي التعطيل الحراري في وجود بولي إيثيلين جلايكول (PEG)، الموجود في محلول الربط السريع، إلى تثبيط التحويل. ب. لم يتم تنقية مزيج الربط السريع قبل المعالجة الكهربائية. يمنع بولي إيثيلين جلايكول (PEG) الموجود في محلول الربط السريع المعالجة الكهربائية. يمكن تنقية نواتج الربط باستخدام عمود طرد مركزي متوفر تجاريًا. ج. تم تحضين الربط السريع طوال الليل. قد يؤدي بولي إيثيلين جلايكول (PEG) الموجود في محلول الربط السريع إلى انخفاض كفاءة التحويل بمرور الوقت. لا توجد فائدة إضافية من ترك تفاعل الربط السريع لأكثر من 30 دقيقة. د. تم تثبيط عملية الربط أو التحويل بسبب ارتفاع نسبة الملح في التفاعل. نظف الحمض النووي. هـ. لم يتم تعطيل أو إزالة الفوسفاتاز (CIP أو BAP أو rSAP) بشكل كامل بعد خطوة إزالة الفوسفات. اتبع الإجراء الموصى به لإزالة الفوسفاتاز أو استخدم فوسفاتاز القطب الجنوبي (NEB #M0289) أو فوسفاتاز الروبيان القلوي (rSAP) (NEB #M0371)، والذي يمكن تعطيله تمامًا بالحرارة في 5 دقائق عند 70 درجة مئوية. تشمل العوامل الأخرى ما يلي: 1. تحلل ATP في المحلول المنظم لأكثر من عام. أضف ATP جديدًا بتركيز 1 ملي مولار. 2. أنتج الربط جزيئات خطية فقط لأن تركيز الحمض النووي كان مرتفعًا جدًا. نوصي بتركيز إجمالي للحمض النووي يتراوح بين 1 و10 ميكروغرام/مل. 3. لا يحتوي كل من الجزء المُدخل والناقل على مجموعات فوسفات. 4. تمت إضافة كمية كبيرة جدًا من خليط الربط إلى الخلايا. نوصي بإضافة 1-5 ميكرولتر إلى 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. خامساً: كان حجم القطعة المُدخلة أكبر من 10 كيلوبايت، ولم تسمح الظروف بتكوين حلقة. قلل تركيز القطعة المُدخلة. سادساً: لم يقم إنزيم القطع بالقطع بكفاءة. عند القطع بالقرب من نهاية قطعة PCR، نوصي بترك 6 أزواج قاعدية على الأقل على جانبي موقع القطع. سابعاً: لم يتم تعطيل إنزيم القطع بشكل كامل. استخدم الفينول/الإيثانول لتنقية الحمض النووي إذا تعذر تعطيل الإنزيم بالحرارة. ثامناً: أدى النشاط الزائد الناتج عن هضم القطع إلى قطع الناقل أو القطعة المُدخلة. افحص الحمض النووي على هلام. إذا ظهرت حزم إضافية، قلل كمية الإنزيم أو وقت هضم القطع. س: لماذا لا ينجح التحويل، وما هي تفاعلات التحكم التي يجب إجراؤها؟ ج: أ. الخلايا غير قابلة للحياة أو غير مؤهلة. قم بإجراء تفاعلات التحكم المذكورة أدناه، واحصل على خلايا جديدة إذا لزم الأمر. ب. لا تتحمل بكتيريا الإشريكية القولونية البروتين المُعاد تركيبه بشكل جيد. جرّب دمج بروتين ربط المالتوز باستخدام نظام pMAL (NEB #E8000S). جرّب نظام تعبير آخر لا يتضمن بكتيريا الإشريكية القولونية. ج. يحتوي الحمض النووي المربوط على تكرارات معكوسة ومتتالية، والتي يتم استبعادها بواسطة بكتيريا الإشريكية القولونية. أزل تسلسل التكرار إن أمكن. جرّب نظام تعبير آخر لا يتضمن بكتيريا الإشريكية القولونية. ملاحظة: استخدم نفس تركيز الحمض النووي لكل عنصر تحكم، عادةً 0.1-1 نانوغرام لكل عملية تحويل. 1. ناقل غير مقطوع للتحقق من حيوية الخلايا واختبار مقاومة البلازميد للمضادات الحيوية. يُزرع على وسط غذائي ووسط غذائي مضاف إليه مضاد حيوي. 2. ناقل مقطوع وغير مربوط: للتحقق من وجود ناقل غير مقطوع، قد يلزم تنقية الهلام لإزالة آخر 0.1% من الناقل غير المقطوع. 3. بلازميد مقطوع ومُعاد ربطه (بدون إدخال) للتحقق من نشاط الليغاز وسلامة نهايات الحمض النووي. يجب أن تكون القيمة 60-70% من القيمة التي تم الحصول عليها للناقل غير المقطوع. 4. يُقطع البلازميد، ويُزال منه الفوسفات، ثم يُعاد ربطه للتحقق من الخلفية الناتجة عن المعالجة غير الكاملة بالفوسفاتاز. يجب أن تكون القيمة أقل من 3% من القيمة المُحصل عليها للناقل غير المقطوع. س: ما هو تركيز إنزيم T4 DNA Ligase المُتوفر في مجموعة الربط السريع؟ ج: 2,000,000 وحدة/مل. وهو نفس تركيز إنزيم T4 DNA Ligase عالي التركيز من NEB (NEB #M0202). س: هل يُمكن استخدام إنزيم T4 DNA Ligase التقليدي (400,000 وحدة/مل) مع محلول الربط السريع؟ ج: عند استخدام إنزيم T4 DNA Ligase التقليدي، يجب زيادة وقت التفاعل إلى 15 دقيقة. لا يُنصح بفترات حضانة أطول من 30 دقيقة. س: كيف يُمكن حساب مولارية النهايات؟ ج: تُوصي NEB باستخدام أداة NEBioCalculator المجانية عبر الإنترنت. ستحسب هذه الأداة مولارية النهايات بالإضافة إلى حسابات رياضية حيوية أخرى. إذا كنت ترغب في الحساب يدويًا، فيرجى ملاحظة ما يلي: المولارية = [(ميكروغرام/ميكرولتر) ÷ (أزواج القواعد × 650 دالتون)] × 2 الأطراف مثال: احسب مولارية الأطراف لناقل خطي بطول 5 كيلوبايت بتركيز 250 نانوغرام/ميكرولتر: [(0.25 ميكروغرام/ميكرولتر) ÷ (5000 × 650 دالتون)] × 2 = 154 نانومولار احسب مولارية الأطراف إذا وضعت 50 نانوغرام من هذا الناقل في تفاعل ربط حجمه 20 ميكرولتر: 50 نانوغرام ÷ 20 ميكرولتر = 0.0025 ميكروغرام/ميكرولتر [(0.0025 ميكروغرام/ميكرولتر) ÷ (5000 × 650)] × 2 = 1.54 نانومولار حدد كمية يلزم إدخال 1 كيلوبايت لتحقيق نسبة 3:1 بين الإدخال والناقل: 3 × 1.54 نانومولار = 4.62 نانومولار [(X ميكروغرام/ميكرولتر) ÷ (1000 × 650)] × 2 = 4.62 نانومولار 0.0015 ميكروغرام/ميكرولتر × 20 ميكرولتر = 0.03 ميكروغرام = 30 نانوغرام. هل يقع هذا التفاعل ضمن النطاق الأمثل من 1 إلى 10 ميكروغرام/مل؟ (50 نانوغرام ناقل + 30 نانوغرام إدخال) ÷ 20 ميكرولتر = 4 ميكروغرام/مل. س: يشير بروتوكول مجموعة الربط السريع إلى أنه لا ينبغي تعطيل التفاعل بالحرارة. كيف يمكنني تعطيل نشاط الربط؟ ج: عادةً لا توجد حاجة لتعطيل تفاعلات الربط السريع. يمكن استخدام هذا التفاعل مباشرةً لتحويل الخلايا المؤهلة كيميائيًا، أو يمكن تنقية الحمض النووي عن طريق الترسيب بالإيثانول، أو التنقية بالهلام، أو باستخدام أي عمود أو خرز مناسب لتنقية الحمض النووي لفصل ناتج الربط عن نشاط الإنزيم ومكونات التفاعل الأخرى. إذا رغبتَ في إيقاف التفاعل دون تنقية، يمكنك إضافة حجم مماثل من محلول EDTA بتركيز 50 ملي مولار وخلطه باستخدام الماصة، إلا أن ذلك سيؤثر على التفاعلات اللاحقة التي تتطلب المغنيسيوم أو كاتيونات ثنائية التكافؤ أخرى.