نيو إنجلاند بيولابس، M2622L، إنزيم ربط الحمض النووي Hi-T4™

هل تبحث عن تركيبات ومتغيرات إضافية من إنزيم T4 DNA Ligase؟ الفئات ذات الصلة: تطبيقات إنزيمات DNA Ligase، BioBrick®، التجميع، الاستنساخ، مواصفات الربط، تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لتحقيق ربط 50% من 6 ميكروغرام من حمض Lambda-HindIII DNA في 30 دقيقة عند 25 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 20 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول تفاعل إنزيم ربط الحمض النووي T4 بتركيز 1X، يُحضن عند درجة حرارة 25 درجة مئوية. محلول تفاعل إنزيم ربط الحمض النووي T4 بتركيز 1X: 50 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار MgCl2، 1 ملي مولار ATP، 10 ملي مولار DTT (الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 10 ملي مولار Tris-HCl، 50 ملي مولار KCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري: 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الأسئلة الشائعة : س: ما هي بعض أسباب فشل تفاعل الربط التي قد تؤدي إلى فشل التحويل؟ ج: فشل الربط بسبب عدم وجود ATP أو Mg2+. استخدم المحلول المرفق أو أضف ATP إلى محلول متوافق. قد يكون ATP الموجود في المحاليل التي يزيد عمرها عن عام قد تحلل بدرجة كافية للتسبب في مشاكل. عند إضافة ATP، تأكد من استخدام ريبوأدينوسين ثلاثي الفوسفات (riboATP) لأن ديوكسي ريبوأدينوسين ثلاثي الفوسفات (deoxyriboATP) لن يُجدي نفعًا. فشل الربط بسبب وجود EDTA في التفاعل. نظّف الحمض النووي (نوصي باستخدام مجموعات تنقية الأحماض النووية Monarch®). لا يتم تعطيل CIP أو BAP أو فوسفاتاز القطب الجنوبي أو SAP بشكل كامل بعد خطوة إزالة الفوسفات. اتبع الإجراء الموصى به لإزالة الفوسفاتاز. كان التركيز مرتفعًا جدًا مما أدى إلى إنتاج حمض نووي خطي فقط أثناء الربط. حافظ على تركيز الحمض النووي الكلي بين 1-10 ميكروغرام/مل. لا يحتوي كل من المُدخل والبلازميد على فوسفات. ملاحظة: قد لا تحتوي البادئات على فوسفات، مما يمنع ربط النهايات غير المتداخلة مع النواقل التي عولجت بـ CIP. اطلب بادئات تحتوي على فوسفات أو قم بفسفرة البادئات باستخدام كيناز عديد النوكليوتيد T4 قبل الاستخدام. تمت إضافة كمية كبيرة جدًا من خليط الربط إلى الخلايا. أضف ما بين 1-5 ميكرولتر إلى 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. كانت القطعة المُدخلة كبيرة ولم تسمح الظروف بتكوين حلقة. قلل تركيز القطعة المُدخلة. كان الليغاز غير نشط. اختبره على حمض نووي لامدا هيند III أو ركيزة مناسبة أخرى. احتوى مزيج الربط على بولي إيثيلين جلايكول (PEG) وتم تحضينه طوال الليل. يؤدي الربط المطول باستخدام PEG إلى انخفاض كفاءة التحويل. قد يكون هذا بسبب الإنتاج التدريجي لقطع خطية كبيرة من الحمض النووي التي يمكن أن تثبط التحويل. يحتوي محلول StickTogether™ DNA Ligase Buffer على PEG. لم يتم تنقية مزيج الربط قبل التحويل الكهربائي. يجب إزالة المحلول وإلا ستتولد شرارة من الملح. قم بغسل العينة أو استخدم عمودًا دوارًا للتنقية (نوصي باستخدام مجموعات تنقية الأحماض النووية من Monarch). يمنع PEG الموجود في محلول StickTogether™ DNA Ligase Buffer حدوث الشرارة ولكنه يمنع أيضًا التحويل الكهربائي. يجب إزالة PEG باستخدام عمود دوار. س: متى يجب أن يكون إنزيم Hi-T4 DNA Ligase هو الإنزيم المفضل؟ ج: بينما يتعطل إنزيم T4 DNA Ligase تدريجيًا عند درجات حرارة أعلى من 37 درجة مئوية، فإن إنزيم Hi-T4 DNA Ligase يتحمل درجات حرارة تصل إلى 45 درجة مئوية لفترات طويلة (تصل إلى 72 ساعة) دون أي فقدان ملحوظ في نشاطه. لذلك، يُعد إنزيم Hi-T4 DNA Ligase الخيار الأمثل إذا كان تفاعل الربط سيُجرى عند درجة حرارة أعلى من 37 درجة مئوية لفترة طويلة (أكثر من 15 دقيقة). س: ما هو المحلول المنظم الذي يجب استخدامه مع إنزيم Hi-T4 DNA Ligase؟ ج: عند محاولة ربط النهايات المتماسكة، نوصي باستخدام إنزيم Hi-T4 DNA Ligase في محلول منظم T4 DNA Ligase بتركيز 1X. أما عند محاولة ربط النهايات غير المتماسكة أو النهايات ذات القاعدة الواحدة البارزة، فيجب استخدام إنزيم Hi-T4 DNA Ligase في محلول StickTogether™ DNA Ligase المحتوي على PEG. تجنب إيقاف التفاعل بالحرارة، لأن معالجة PEG بالحرارة في محلول StickTogether™ DNA Ligase ستمنع عملية التحويل. س: ما هو نشاط إنزيم Hi-T4 DNA Ligase في محاليل منظمة أخرى؟ ج: يكون إنزيم Hi-T4 DNA Ligase نشطًا بنسبة 100% في محلول T4 DNA Ligase المنظم. ومثل إنزيم T4 DNA Ligase، ينخفض ​​نشاط إنزيم Hi-T4 DNA Ligase في محلول NEBuffer 3/r3.1 ومحلول HiFi Taq DNA Ligase المنظم نظرًا لارتفاع محتواهما من الأملاح. الجدول التالي يوضح نسبة النشاط في كل محلول منظم: 1. محلول T4 DNA Ligase المنظم: 100%، محلول NEBuffer r1.12 المنظم: 100%، محلول NEBuffer r2.12 المنظم: 100%، محلول NEBuffer r3.12 المنظم: 50%، محلول rCutSmart® المنظم: 100%، محلول Taq DNA Ligase المنظم: 100%، محلول HiFi Taq DNA Ligase المنظم: 50%. 1. النشاط مُقارنةً بالنشاط على ركيزة طرفية متماسكة في محلول T4 DNA Ligase المنظم (عند 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق). 2. مُضاف إليه 1 ملي مول من ATP. يرجى التأكد من استخدام ريبوأدينوسين ثلاثي الفوسفات (NEB #P0756) لأن ديوكسي ريبوأدينوسين ثلاثي الفوسفات لن يعمل. لمعرفة نسبة نشاطه الوظيفي في CutSmart، ونسبة نشاط إنزيمات تعديل الحمض النووي الأخرى في عملية الاستنساخ، راجع مخطط نشاط إنزيمات تعديل الحمض النووي في محلول CutSmart®. س: هل يمكن تعطيل هذا الليغاز بالحرارة؟ ج: نعم، تمامًا مثل ليغاز الحمض النووي T4، يمكن تعطيل هذا الليغاز بالحرارة لمدة 10 دقائق عند 65 درجة مئوية. لا تقم بتعطيله بالحرارة إذا كان هناك بولي إيثيلين جلايكول (PEG) في محلول التفاعل (محلول StickTogether™ DNA Ligase Buffer)، حيث سيتم تثبيط عملية التحويل. س: ما الفرق بين تعريفات وحدات ليغاز الحمض النووي T4 (NEB #M0202) وليغاز الحمض النووي Hi-T4 (NEB #M2622)؟ ج: يُعرَّف كلٌّ من إنزيم T4 DNA Ligase وإنزيم Hi-T4 DNA Ligase بوحدة ربط 50% من 6 ميكروغرام من شظايا HindIII، إلا أن درجة حرارة الحضانة تختلف. تُحدَّد وحدة T4 DNA Ligase عند 16 درجة مئوية، بينما تُحدَّد وحدة Hi-T4 DNA Ligase عند 25 درجة مئوية. س: ما كمية الحمض النووي (DNA) التي يجب استخدامها في عملية الربط باستخدام هذا الإنزيم؟ ج: تستخدم الوحدة 6 ميكروغرام من شظية HindIII. يمكن استخدام هذا التركيز العالي من الحمض النووي لربط الوصلات. ولتعزيز تكوين الدوائر، وهو أمر مفيد في التحويل، يُنصح باستخدام تركيز إجمالي أقل من الحمض النووي. يجب أن يتراوح التركيز الإجمالي للناقل + القطعة المُدرجة بين 1 و10 ميكروغرام/مل لتحقيق ربط فعال. يُوصى بنسب مولية للناقل إلى القطعة المُدرجة تتراوح بين 1:1 و1:10 (1:3 هي النسبة النموذجية). إذا لم تكن متأكدًا من تركيزات الحمض النووي لديك، فقم بإجراء عمليات ربط متعددة بنسب مختلفة.