نيو إنجلاند بيولابس، M3004X، مزيج لونا® العالمي لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR)

الفئات ذات الصلة: Luna® qPCR وRT-qPCR، تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، تطبيقات تقنيات التضخيم qPCR وRT-qPCR القائمة على المجسات، qPCR وRT-qPCR، RT-qPCR ثنائي الخطوات، الأسئلة الشائعة : س: كيف أستخدم qPCR لتحديد تركيز المادة؟ ج: يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) التألق في الوقت الحقيقي لقياس كمية الحمض النووي الموجودة في كل دورة أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل. تم تطوير مجموعة متنوعة من الطرق لتوليد إشارة فلورية، وأكثرها شيوعًا استخدام مجسات التحلل المائي (مثل TaqMan®)، أو صبغة ربط الحمض النووي ثنائي السلسلة (مثل SYBR® Green). عند النقطة التي يمكن فيها اكتشاف إشارة التألق qPCR فوق تألق الخلفية، يمكن تحديد دورة التحديد الكمي، أو قيمة Cq. يمكن استخدام قيم Cq لتقييم الوفرة النسبية للهدف بين عينتين أو أكثر. بدلاً من ذلك، يمكن استخدامها لحساب الكميات المستهدفة المطلقة بالرجوع إلى منحنى معياري مناسب، مُستمد من سلسلة من تخفيفات الحمض النووي المعروفة. عادةً، يقوم برنامج جهاز qPCR بإجراء عمليات الرسم والحسابات اللازمة لتحديد التركيز. كما تتضمن أدوات NEB الإلكترونية حاسبة qPCR، والتي يمكن العثور عليها على الموقع NEBiocalculator.neb.com. س: هل يمكنني إعداد جهاز Luna® qPCR في درجة حرارة الغرفة؟ ج: نعم. يمكن إعداد جهاز Luna qPCR في درجة حرارة الغرفة، ولكن للحصول على أفضل النتائج، يجب حفظ التفاعلات على الجليد قبل بدء دورات التفاعل الحراري. يحتوي بوليميراز الحمض النووي الموجود في مزيج qPCR الرئيسي، وهو بوليميراز الحمض النووي Taq Hot Start من NEB (NEB #M0495)، على أبتامر مُعدَّل فريد (SOMAmer®) للتحكم في النشاط المعتمد على درجة الحرارة، ويتم تثبيطه عند درجة حرارة أقل من 45 درجة مئوية. يمنع هذا التثبيط العكسي النشاط غير المرغوب فيه وغير المحدد حتى يتم تسخين التفاعل فوق درجة حرارة الإطلاق خلال خطوة التمسخ الأولية لدورة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). س: ما الفرق بين نسخ مزيج Luna® qPCR المعتمدة على المجسات والصبغات؟ ج: يُقاس تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) عادةً بإحدى طريقتين: إما باستخدام صبغة متداخلة تُصدر فلورة أقوى عند ارتباطها بالحمض النووي المزدوج، أو باستخدام أوليغونوكليوتيد "مجس" موسوم بفلورة يرتبط بتسلسل محدد في ناتج تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل. ويتم منع الفلورة الخلفية للمجس بوجود مجموعة مثبطة. في حالة مجسات التحلل المائي، يتم فصل المثبط عن الفلوروفور أثناء التضخيم بواسطة نشاط النيوكلياز 5´→3´ لإنزيم بوليميراز الحمض النووي Taq. ولتمكين الكشف المعتمد على الصبغات، يحتوي مزيج Luna Universal qPCR على صبغة متداخلة يتم الكشف عنها في قناة SYBR® Green أو FAM لمعظم أجهزة الوقت الحقيقي. لا تحتوي منتجات Luna Universal Probe qPCR على صبغة ربط الحمض النووي المزدوج (لأنها ستتداخل مع استخدام المجسات الموسومة بـ FAM). يجب على المستخدمين إضافة مجس أوليغونوكليوتيد موسوم إلى المزيج، بالإضافة إلى بادئات PCR الأمامية والخلفية. يُرجى ملاحظة أن صبغة المرجع السلبية الموجودة في كلا المزيجين لا تتداخل مع استخدام المجسات الموسومة بـ ROX. س: هل يجب عليّ استخدام الكشف القائم على المجسات أم الكشف القائم على الصبغة في فحوصات qPCR؟ ج: يتطلب الكشف القائم على الصبغة (مثل SYBR® Green) إضافة بادئات PCR فقط، مما يجعله خيارًا اقتصاديًا لـ qPCR. مع ذلك، ستكشف الصبغة المتداخلة عن أي حمض نووي مزدوج السلسلة (dsDNA) ينتج في التفاعل. لذلك، قد يُلاحظ تضخيم خارج الهدف أو تضخيم غير مرتبط بالقالب (NTC) لبعض مجموعات البادئات، مما يؤدي إلى قياس كمي غير دقيق. يمكن استخدام منحنيات التمسخ (الذوبان) التي تُجرى بعد تفاعل PCR للتمييز بين المنتجات الصحيحة وغير النوعية. بالإضافة إلى ذلك، لا يمكن قياس سوى مُضخَّم واحد في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) القائم على الصبغة، دون إمكانية إجراء تفاعلات متعددة. يتطلب الكشف القائم على المجسات تصميمَ والحصولَ على مجس أوليغونوكليوتيد مُوسَم بفلوروفور مُحدد التسلسل، بالإضافة إلى بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدية. هذا يزيد من تكاليف التحليل، لكن تجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي القائمة على المجسات تتميز بدقة عالية للغاية، ومن غير المرجح أن تؤدي إلى قياس كمي غير دقيق بسبب تضخيم NTC. تُصبح التفاعلات المتعددة ممكنة باستخدام المجسات، حيث يمكن تصميم مُضخَّمات مختلفة باستخدام فلوروفورات فريدة وفقًا للإمكانيات البصرية لجهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي. س: كيف يُمكنني تصميم البادئات لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي Luna®؟ ج: نوصي باستخدام برنامج تصميم البادئات (مثل Primer3) لاختيار تسلسلات الهدف والبادئات لزيادة كفاءة التضخيم إلى أقصى حد مع تقليل التضخيم غير المحدد وثنائيات البادئات. يتوافق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي Luna أيضًا مع فحوصات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي المتوفرة تجاريًا. عند تصميم البادئات يدويًا، ننصح بتصميم مُضخّمات قصيرة (من 70 إلى 200 زوج قاعدي) ذات محتوى GC متوازن (40-60%). استهدف درجة حرارة انصهار (Tm) تقارب 60 درجة مئوية باستخدام إعدادات Hot Start Taq في حاسبة Tm من NEB (TmCalculator.neb.com). بالنسبة لأهداف cDNA وRNA، يُنصح بتصميم البادئات عبر مواقع الربط المعروفة (وصلات الإكسون-إكسون) لمنع التضخيم من الحمض النووي الجينومي. س: ما هو طول المُضخّم المناسب لتفاعل qPCR؟ ج: من العوامل المهمة في تجربة qPCR زيادة كفاءة تضخيم PCR، وتساعد المُضخّمات القصيرة على ضمان كفاءة عالية. يتراوح طول مُضخّمات qPCR النموذجية بين 70 و200 زوج قاعدي، ونوصي بتصميم هدفك ضمن هذا النطاق. يمكن استخدام مُضخّمات أطول، ولكن قد يتطلب ذلك تحسينًا (مثل زيادة أوقات التمديد). س: لماذا لون مزيج Luna® qPCR أزرق؟ هل يؤثر هذا الصبغ على عملية الكشف؟ ج: يحتوي مزيج Luna® qPCR على صبغة مرجعية بصرية خاملة تُعطي المزيج لونًا أزرقًا واضحًا. يُسهّل هذا اللون تحديد الآبار التي تم تحميلها بالكواشف في لوحة qPCR، وهو أمر قد يكون صعبًا نظرًا لصغر حجم الآبار وطبيعة العديد من لوحات qPCR ذات 96 و384 بئرًا غير الشفافة. خضعت الصبغة الزرقاء لتقييمات مكثفة في تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وqPCR، وهي لا تُعيق أو تتداخل مع عملية الكشف في qPCR. س: هل يُمكنني تشغيل مزيج Luna® qPCR على جهاز qPCR الخاص بي؟ ج: تحتوي مزيجات Luna® qPCR التالية على صبغة مرجعية سلبية عالمية تُتيح التوافق مع مجموعة واسعة من أجهزة الوقت الحقيقي، بما في ذلك تلك التي لا تستخدم صبغة مرجعية سلبية للتطبيع (مثل Bio-Rad® CFX)، أو تلك التي تستخدم صبغة مرجعية سلبية منخفضة التركيز (مثل Applied Biosystems® 7500 أو QuantStudio®)، أو تلك التي تستخدم صبغة مرجعية سلبية عالية التركيز (مثل Applied Biosystems 7900 أو StepOne®). مزيج Luna Universal qPCR Master Mix (NEB #M3003) ومزيج Luna Universal Probe qPCR Master Mix (NEB #M3004) ومجموعة Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit (NEB #E3005) ومجموعة Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit (NEB #E3006) ومزيج Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix with UDG (NEB #M3019) ومزيج LyoPrime Luna Probe One-Step RT-qPCR Mix with UDG (NEB #L4001). تفتقر مجموعة Luna Probe One-Step RT-qPCR Kit (No ROX) (NEB #E3007) ومجموعة Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix with UDG (No ROX) (NEB #M3029) إلى صبغة مرجعية ويمكن استخدامها مع أي جهاز لا يتطلب معايرة ROX. يرجى الرجوع إلى تعليمات الشركة المصنعة للجهاز لمزيد من التفاصيل. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام مزيج Luna مع ظروف دورات قياسية أو سريعة. س: هل يمكنني استخدام إعدادات الجهاز السريعة مع مزيج Luna® qPCR؟ ج: يتوافق مزيج Luna qPCR مع سرعات التسخين السريعة والقياسية على الأجهزة التي تدعم كلا السرعتين. نوصي بدرجات حرارة وأوقات دورات محددة (راجع البروتوكول أو الدليل لمزيد من المعلومات)، ولكن يمكن استخدام أي من إعدادات التسخين مع ظروف الدورات هذه. (ملاحظة: يجب التحقق من ظروف الدورات بعد تغيير إعداد سرعة التسخين؛ في بعض أجهزة الوقت الحقيقي، سيؤدي تغيير سرعة التسخين أيضًا إلى إعادة ظروف الدورات إلى الإعداد الافتراضي للجهاز). س: هل أحتاج إلى إضافة ROX؟ ج: توصي بعض أجهزة الوقت الحقيقي باستخدام صبغة مرجعية سلبية (عادةً ROX) للتغلب على الاختلافات بين الآبار التي قد تنتج عن قيود الجهاز مثل "تأثير الحافة" والفقاعات والاختلافات الطفيفة في الحجم والتألق الذاتي من الغبار أو الجسيمات في التفاعل. مع ذلك، لا يُسهم توحيد ROX إلا ​​قليلاً في معالجة التباينات الناتجة عن أخطاء سحب القوالب/البادئات، والخلط غير المتجانس، ومشاكل التبخر/التكثيف. تحتوي منتجات Luna® qPCR التالية على صبغة مرجعية سلبية شاملة تُمكّن من التوافق مع مجموعة متنوعة من أجهزة الوقت الحقيقي، بما في ذلك تلك التي لا تستخدم توحيدًا مرجعيًا سلبيًا وتلك التي تستخدم كمية منخفضة أو عالية من الصبغة المرجعية السلبية (ROX). مزيج Luna Universal qPCR Master Mix (NEB #M3003) ومزيج Luna Universal Probe qPCR Master Mix (NEB #M3004) ومجموعة Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit (NEB #E3005) ومجموعة Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit (NEB #E3006) ومزيج Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix with UDG (NEB #M3019) ومزيج LyoPrime Luna Probe One-Step RT-qPCR Mix with UDG (NEB #L4001) ومجموعة Luna Probe One-Step RT-qPCR Kit (No ROX) (NEB #E3007) ومزيج Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix with UDG (No ROX) (NEB #M3029) تفتقر إلى صبغة مرجعية ويمكن استخدامها مع أي جهاز لا يتطلب معايرة ROX. يرجى الرجوع إلى تعليمات الشركة المصنعة للجهاز لمزيد من التفاصيل. أجهزة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR): Bio-Rad® iQ™5، CFX96، CFX384، Opticon، Roche Lightcycler®، Qiagen Rotor-Gene™، Eppendorf Mastercycler®، Cepheid® SmartCycler®. غير موصى به/مطلوب: Applied Biosystems® 7500، 7500 Fast، QuantStudio™، ViiA7™، Agilent Mx™. تركيز منخفض من ROX (~50 نانومتر نهائي). Applied Biosystems® 5700، 7000، 7300، 7700، 7900، 7900HT، 7900HT Fast، StepOne™، StepOnePlus™. تركيز عالٍ من ROX (~500 نانومتر نهائي). س: كم عدد التخفيفات التي يجب استخدامها لإنشاء منحنى قياسي؟ ج: تتضمن تجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) النموذجية معايير تغطي خمسة رتب مقدارية (خمسة تخفيفات متسلسلة عشرية) لإنشاء منحنى معياري. اختر أقل كمية معيارية تمثل نسخة واحدة تقريبًا من الهدف عند الرغبة في الحصول على أقصى حساسية. يمكن زيادة أو تقليل عدد النقاط على المنحنى المعياري حسب الرغبة، ويمكن استخدام ثلاث نقاط فقط عندما يكون الهدف والفحص والعينة موصوفة جيدًا. س: لماذا توصي NEB بـ 40-45 دورة؟ ج: تضخيم 40 دورة كافٍ للأهداف ذات النسخ العالية، أو عند استخدام فحص موصوف جيدًا حيث لا يمثل تضخيم غير القالب مصدر قلق. نقترح 45 دورة لزيادة الثقة في الكشف عن الأهداف ذات النسخ المنخفضة إلى نسخة واحدة. قد تساعد الدورات الإضافية أيضًا في الكشف عن التضخيم غير المحدد لمجموعة بادئات معينة عند استخدام مخاليط qPCR القائمة على الصبغة. س: هل يحتوي مزيج Luna® qPCR على dUTP؟ هل يمكنني استخدام طرق منع التلوث المتبقي؟ ج: نعم، تم تركيب مزيج Luna® qPCR Mix بمزيج من dTTP وdUTP. يضمن هذا تضخيمًا فعالًا لـ PCR، بالإضافة إلى دمج dU في المنتجات أثناء تفاعل qPCR. تعمل منتجات qPCR التي تحتوي على dU كركيزة لإنزيم يوراسيل دي إن إيه جليكوزيلاز، مما يمنع التلوث العابر. إذا كان الهدف من التضخيم هو الاستخدام الروتيني، أو إذا كان سيتم فتح أوعية qPCR، أو إذا كان تجنب التلوث العابر مرغوبًا فيه، فيمكن إضافة 0.025 وحدة/ميكرولتر من إنزيم Antarctic Thermolabile UDG (NEB #M0372) إلى مزيج التفاعل. عند إضافة إنزيم Antarctic Thermolabile UDG، يُرجى إعداد تجارب qPCR في درجة حرارة الغرفة أو إضافة خطوة حضانة لمدة دقيقتين عند 25 درجة مئوية قبل ظروف التدوير الافتراضية. س: هل يمكنني إجراء تفاعلات متعددة باستخدام مزيج Luna® Universal Probe Master Mix؟ هل أحتاج إلى تغيير ظروف التفاعل؟ ج: نعم، لقد تم بنجاح إجراء تفاعلات متعددة لتضخيم ما يصل إلى 3 أهداف باستخدام مزيج Luna Probe Mix. اختر الفلوروفورات المختلفة التي تتوافق مع قنوات الكشف المنفصلة للجهاز في الوقت الحقيقي. يجب اختبار كل هدف في تفاعل أحادي أولاً. لكل مُضخَّم، ابدأ بإضافة 400 نانومتر من البادئ الأمامي والخلفي و200 نانومتر من المجس في كل تفاعل. إذا لوحظ تدهور في أداء مُضخَّم معين عند استخدامه في فحص متعدد مقارنةً بنتائجه الأحادية، فقد تتطلب التفاعلات تحسينًا. قد يكون من المفيد تقليل تركيزات البادئ للأهداف الوفيرة أو ذات النسخ العالية و/أو زيادة تركيزات البادئ للأهداف قليلة الوفرة أو ذات النسخ المنخفضة. قد يلزم إجراء المزيد من التحسين مع زيادة التعدد، باستخدام المعايير التالية كإرشادات: البادئ 200-900 نانومتر، المجس 100-500 نانومتر. مثال على تفاعل ثلاثي باستخدام مزيج Luna Universal Probe Master Mix على جهاز Applied Biosystems® 7500 Fast. س: هل يُمكنني استخدام مسبار مُوسَم بـ ROX مع مزيج Luna® Probe Mixes الذي يحتوي على صبغة مرجعية عالمية ROX؟ ج: نعم. مع ذلك، يجب مراعاة متطلبات المعايرة المرجعية السلبية لجهاز الوقت الحقيقي. بالنسبة للأجهزة التي لا تستخدم معايرة ROX، يُمكن عمومًا استخدام مسبار ROX دون قلق أو تعديل الجهاز. أما بالنسبة للأجهزة التي تستخدم ROX للمعايرة، فلا يُنصح عادةً باستخدام مسابير ROX، وهذا الخيار غير مُتاح في إعدادات الجهاز النموذجية. لا يزال من الممكن استخدام مسابير ROX بشرط إيقاف تشغيل معايرة ROX، ولكن ستُفقد فوائد المعايرة. بالنسبة لمن يُفضلون مزيجًا خاليًا من ROX، يُرجى الاطلاع على Luna Probe One-Step RT-qPCR Kit (بدون ROX) (NEB# E3007) أو Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix with UDG (بدون ROX) (NEB #M3029)، أو التواصل عبر البريد الإلكتروني info@neb.com. س: هل يمكن استخدام استراتيجيات كشف بديلة تعتمد على المجسات مع مزيج مجسات Luna®؟ ج: نعم. لقد تم اختبار مجسات Molecular beacon وScorpions® بنجاح مع مزيج مجسات Luna. كما يمكن استخدام تصميمات مجسات أخرى شريطة أن تكون متوافقة مع نشاط إنزيم Hot Start Taq DNA Polymerase من نوع 5´→3´. س: ما هي العينات التي يمكن استخدامها في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) مع مزيج Luna®؟ ج: للحصول على أفضل النتائج، نوصي باستخلاص أو تنقية المادة الأولية من الحمض النووي (DNA/RNA). تعمل مزيجات Luna qPCR Master Mix مع الأحماض النووية من أنواع مختلفة من العينات التي تم تنقيتها باستخدام الطرق التقليدية القائمة على الأعمدة. (على سبيل المثال، مجموعة تنقية الحمض النووي الجينومي Monarch® (NEB #T3010)). على الرغم من أن مزيج Luna qPCR الرئيسي متوافق مع مجموعة متنوعة من مجموعات cDNA الشائعة الاستخدام، إلا أننا نوصي باستخدام مجموعة LunaScript® RT SuperMix (NEB #E3010) قبل مزيج Luna qPCR الرئيسي في سير عمل RT-qPCR ثنائي الخطوات. لا يلزم تنقية cDNA قبل استخدامه في Luna qPCR، ولكن يجب تخفيفه بنسبة 1:10 على الأقل في تفاعل qPCR. س: هل يمكنني استخدام cDNA؟ هل تختلف طريقة تحضيره؟ ج: يعمل مزيج Luna® qPCR الرئيسي بكفاءة عالية مع cDNA المُحضر باستخدام مجموعات تخليق cDNA المتوفرة تجاريًا. على الرغم من أن Luna qPCR متوافق مع مجموعة متنوعة من مجموعات cDNA الشائعة الاستخدام، إلا أننا نوصي باستخدام مجموعة Protoscript® II لتخليق السلسلة الأولى (NEB #E6560). لا يلزم تنقية cDNA قبل استخدامه في Luna qPCR. لكن يجب تخفيفه بنسبة 1:10 على الأقل في تفاعل qPCR. س: ما مقدار المادة القالبية التي يمكنني استخدامها في Luna® qPCR؟ ج: بشكل عام، يكون التركيز الأمثل للمادة القياسية والمادة المجهولة في حدود 10⁶-1 نسخة، مع اختلاف كمية الحمض النووي المدخلة المقابلة باختلاف حجم الجينوم. بالنسبة للجينومات الكبيرة (مثل الحمض النووي الجينومي البشري)، نوصي باستخدام ما بين 50 نانوغرام و10 بيكوغرام من الحمض النووي. س: ما مقدار البادئ والمسبار الذي يجب استخدامه مع مزيج Luna® Universal Probe qPCR Master Mix؟ ج: بالنسبة لمعظم الأهداف، يوفر التركيز النهائي 400 نانومولار لكل بادئ و200 نانومولار للمسبار الأداء الأمثل. إذا لزم الأمر، يمكن تحسين التركيز النهائي للبادئ بين 200 و900 نانومولار، ويمكن تحسين التركيز النهائي للمسبار بين 100 و500 نانومولار. س: هل يمكنني استخدام أوقات دورات أقصر؟ ج: نعم. بالنسبة للعديد من الأهداف، يمكن استخدام أوقات حضانة أقصر في كل دورة. خطوة. ومع ذلك، يوصى باستخدام ظروف التدوير القياسية كنقطة بداية، وقد تكون مطلوبة للاختبارات الصعبة مثل تلك التي تحتوي على كمية قليلة من الحمض النووي.