نيو إنجلاند بيولابس، M3010X، لونا سكريبت® RT سوبر ميكس

إصدار Supermix فقط؛ لا يشمل هذا المنتج مزيج تحكم No-RT أو ماءً خاليًا من النيوكلياز. الفئات ذات الصلة : Luna® qPCR وRT-qPCR، تطبيقات تخليق cDNA وإنزيمات النسخ العكسي، qPCR وRT-qPCR، RT-qPCR ثنائي الخطوة، النسخ العكسي (تخليق cDNA)، الأسئلة الشائعة: س: هل يمكنني استخدام عينات RNA مُنقّاة من ظروف تخزين مختلفة مثل RNALater في تفاعلات تخليق cDNA الخاصة بي باستخدام LunaScript®؟ ج: بشكل عام، تعمل عينات RNA المُنقّاة من مصادر مختلفة بشكل جيد مع منتجات LunaScript. نوصي عادةً بتنقية RNA باستخدام طرق تعتمد على الأعمدة (مثل Monarch® RNA Miniprep Kit (NEB #T2010S)). س: هل يمكنني إضافة بادئات خاصة بالجينات في تفاعل تخليق cDNA الخاص بي باستخدام LunaScript®؟ ج: تم تحسين LunaScript RT SuperMix للكشف الكمي التفاعلي العكسي ثنائي الخطوات (RT-qPCR)، ويحتوي على كل ما يلزم لتخليق الحمض النووي المكمل (cDNA)، بما في ذلك بادئ dT وبادئ سداسي عشوائي. إذا كنت ترغب في استخدام بادئات بديلة أو خاصة بجين معين لتخليق الحمض النووي المكمل، فإن LunaScript RT Master Mix Kit (بدون بادئات) هو الخيار الأنسب. LunaScript RT Master Mix (بدون بادئات) (NEB #3025) مطابق لـ LunaScript RT SuperMix ولكن بدون بادئات. س: هل يمكنني إجراء تفاعل تخليق الحمض النووي المكمل في درجة حرارة الغرفة عند استخدام LunaScript® RT SuperMix؟ ج: نعم. يمكن إجراء تفاعلات تخليق الحمض النووي المكمل باستخدام LunaScript في درجة حرارة الغرفة. س: هل يمكنني استخدام وقت حضانة أقصر لتفاعل تخليق الحمض النووي المكمل عند استخدام LunaScript® RT SuperMix؟ ج: نعم. بالنسبة للعديد من الأهداف، يمكن استخدام أوقات حضانة قصيرة تصل إلى دقيقتين لخطوة تخليق الحمض النووي المكمل عند 55 درجة مئوية. مع ذلك، يُنصح باستخدام ظروف التدوير القياسية كنقطة بداية، وقد تكون ضرورية للاختبارات المعقدة، و/أو مع عينات الحمض النووي الريبوزي (RNA) التي تحتوي على شوائب. س: هل يمكنني استخدام منتجات LunaScript® cDNA مباشرةً في تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR)؟ ما هي الكمية التي يمكنني استخدامها للكشف في تفاعل qPCR؟ ج: يمكن استخدام منتج cDNA مباشرةً في تفاعل qPCR. بشكل عام، نوصي باستخدام 1 ميكرولتر من منتج cDNA في 20 ميكرولتر من تفاعل qPCR للكشف. عند الحاجة، يمكن استخدام ما يصل إلى 20% من حجم تفاعل qPCR كمنتج cDNA غير مخفف (على سبيل المثال، 4 ميكرولتر من منتج cDNA في 20 ميكرولتر من تفاعل qPCR). س: ما هي كمية قالب الحمض النووي الريبوزي (RNA) التي يجب استخدامها في تفاعلات تخليق LunaScript® cDNA؟ ج: تعمل خلطات LunaScript بشكل جيد مع قوالب الحمض النووي الريبوزي (RNA) المنقاة، بما في ذلك الحمض النووي الريبوزي الكلي (RNA)، والحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA)، وعينات النسخ المختبرية. الكمية في تفاعل 20 ميكرولتر: إجمالي الحمض النووي الريبوزي ≤ 1 ميكروغرام، الحمض النووي الريبوزي متعدد الأدينين ≤ 1 ميكروغرام، النسخ المخبرية 100 نانوغرام. س: كيف يُخزَّن منتج LunaScript® cDNA؟ ج: يُمكن تخزين منتج cDNA عند 4 درجات مئوية للاستخدام قصير المدى. أما للتخزين طويل المدى، فيُفضَّل تخزينه عند -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية. س: كيف أختار بين طريقة RT-qPCR أحادية الخطوة أو ثنائية الخطوة؟ ج: تتوفر طريقتان لتحديد كمية عينات الحمض النووي الريبوزي: RT-qPCR أحادية الخطوة وثنائية الخطوة. في كلتا الحالتين، يُنسخ الحمض النووي الريبوزي عكسيًا إلى cDNA، والذي يُستخدم بعد ذلك كقالب لتضخيم qPCR. يُمكن إجراء النسخ العكسي بشكل منفصل عن qPCR (أي RT-qPCR ثنائية الخطوة) أو مباشرةً في مزيج qPCR (أي RT-qPCR أحادية الخطوة). تُفضّل عادةً إجراءات العمل أحادية الخطوة في فحوصات التشخيص الجزيئي، حيث قد تكون كمية العينات محدودة أو عند فحص عينات عديدة. يُفضّل استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي ثنائي الخطوة (RT-qPCR) عند إجراء عدة تحليلات على نفس المادة الأولية أو عند الحاجة إلى أرشفة الحمض النووي التكميلي (cDNA). لمزيد من التفاصيل، يُرجى الرجوع إلى "اختيار تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي أحادي الخطوة أو ثنائي الخطوة". سؤال: هل يجب تضمين تفاعل تحكم بدون إنزيم النسخ العكسي (RT) عند إعداد تفاعل تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA)؟ جواب: نعم. عند وجود الحمض النووي الجينومي أو نواتج النقل، قد تتداخل مع التحديد الكمي الدقيق للحمض النووي الريبوزي (RNA)، خاصةً للأهداف ذات النسخ المنخفضة. لذلك، من المهم إجراء تفاعلات التحكم المناسبة بدون إنزيم النسخ العكسي (No-RT) لمراعاة هذه التأثيرات. بالإضافة إلى ذلك، يجب إعداد تفاعلات تحكم بدون قالب (NTC) لإثبات أن التفاعلات الإيجابية ذات دلالة. يُرجى الرجوع إلى مجموعة LunaScript RT SuperMix (NEB #E3010) إذا كنت بحاجة إلى مزيج تحكم بدون إنزيم النسخ العكسي (No-RT). س: ما هي كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) التي توصون بها للكشف عن منتجات الحمض النووي المكمل (cDNA)؟ ج: خضعت منتجات الحمض النووي المكمل (cDNA) المُنتجة باستخدام مزيج LunaScript® لتقييمات مكثفة في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) باستخدام مزيج Luna® Universal qPCR Master Mix (NEB #M3003) ومزيج Luna Universal Probe qPCR Master Mix (NEB #M3004). يوفر هذان المنتجان معًا سير عمل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي (RT-qPCR) من خطوتين بحساسية ممتازة وقياس كمي خطي دقيق. بالإضافة إلى ذلك، يتوافق LunaScript مع مزيجات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) التجارية الرئيسية الأخرى. س: ما هي درجة الحرارة المناسبة لتفاعل تخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) باستخدام LunaScript®؟ ج: يدعم إنزيم النسخ العكسي Luna® المقاوم للحرارة تخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) بكفاءة عالية عند درجات حرارة مرتفعة مقارنةً بإنزيم النسخ العكسي MMLV RT. بالنسبة لمعظم الأهداف، يمكن إتمام تخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) بحضانة لمدة 10 دقائق عند 55 درجة مئوية. أما بالنسبة للقوالب الصعبة، فيمكن رفع درجة حرارة تخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) إلى 65 درجة مئوية. س: لماذا أحصل على كميات قليلة من الحمض النووي التكميلي (cDNA)؟ ج: هناك عدة أسباب لانخفاض كمية الحمض النووي التكميلي (cDNA). إليك بعض الاقتراحات لتحسين الكمية: تحقق من سلامة الحمض النووي الريبوزي (RNA) عن طريق الفصل الكهربائي على هلام الأغاروز المُشوه أو باستخدام جهاز BioAnalyzer (Agilent). يُعدّ الحمض النووي الريبوزي (RNA) السليم عالي النقاء ضروريًا لتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) كامل الطول. يجب أن يكون للحمض النووي الريبوزي (RNA) نسبة امتصاص ضوئي عند 260 نانومتر إلى امتصاص ضوئي عند 280 نانومتر (A260/A280) لا تقل عن 1.7 أو رقم RIN أكبر من 8. يمكن إزالة الملوثات مثل EDTA والجوانيدينيوم عن طريق الترسيب بالإيثانول متبوعًا بغسل بالإيثانول بنسبة 70%. يمكن إزالة السكريات المتعددة عن طريق الترسيب باستخدام كلوريد الليثيوم. يمكن إزالة البروتينات الملوثة مثل البروتيازات عن طريق خطوة تنقية الحمض النووي الريبوزي (RNA) باستخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA) أو استخلاص الفينول/الكلوروفورم. زد كمية الحمض النووي الريبوزي (RNA) المستخدمة، خاصةً للحمض النووي الريبوزي (RNA) منخفض الوفرة. س: هل ستؤثر الصبغة الزرقاء في LunaScript® RT SuperMix على عملية الكشف؟ ج: تحتوي منتجات LunaScript على صبغة مرجعية بصرية خاملة تُضفي على المزيج لونًا أزرقًا صافيًا. يُسهّل هذا اللون عملية تتبع إعداد التفاعل من خلال تحديد وجود أو عدم وجود تفاعلات cDNA، بالإضافة إلى تحديد اختلافات الحجم داخل الأنابيب، وأطراف الماصات، وتفاعلات qPCR اللاحقة. وقد خضعت الصبغة الزرقاء لتقييمات مكثفة في تجارب تخليق cDNA وqPCR، ولم يُلاحظ أنها تُثبّط أو تتداخل مع الكشف عن RNA. س: كيف أختار بين مجموعات تخليق cDNA من السلسلة الأولى من NEB؟ ج: يُبرز الجدول 1 المزايا والتطبيقات الرئيسية لمجموعات تخليق cDNA من السلسلة الأولى من NEB. مجموعات تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) مجموعة LunaScript® RT SuperMix (NEB #E3010) مجموعة LunaScript RT Master Mix (خالية من البادئات) (NEB #E3025) مجموعة ProtoScript® II لتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) من السلسلة الأولى (NEB #E6560) المكونات: LunaScript RT SuperMix (5X)* مزيج التحكم بدون RT (5X)* ماء خالٍ من النيوكلياز *يحتوي كلا المزيجين على سداسي النيوكليوتيدات وd(T)10 LunaScript RT Master Mix (خالية من البادئات) (5X) مزيج التحكم بدون RT (خالية من البادئات) (5X) ماء خالٍ من النيوكلياز ProtoScript II Enzyme Mix (10X) ProtoScript II Reaction Mix (2X) Oligo d(T)23VN (50 ميكرومولار) مزيج البادئات العشوائية (60 ميكرومولار) ماء خالٍ من النيوكلياز التنسيق التطبيق الموصى به البادئات الحضانة لـ RT-qPCR ثنائي الخطوات الكشف باستخدام سداسي النيوكليوتيدات وd(T)10: 25 درجة مئوية لمدة دقيقتين؛ 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق؛ 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. للكشف باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي (RT-qPCR) ثنائي الخطوات: مزيج البادئات العشوائية: 25 درجة مئوية لمدة دقيقتين؛ 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق؛ 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. لتخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) العام: d(T)23VN أو بادئات خاصة بالجين: 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق؛ 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. مزيج البادئات العشوائية: 25 درجة مئوية لمدة دقيقتين؛ 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق؛ 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. لتخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) العام: d(T)23VN أو بادئات خاصة بالجين: 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة؛ 80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. مزيج البادئات العشوائية: 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. ٨٠ درجة مئوية ٥ دقائق المزايا ✓ مزيج فائق ✓ بروتوكول قصير ✓ مؤشر تتبع مرئي ✓ درجة حرارة تفاعل أعلى ✓ حجم أكبر من الحمض النووي الريبوزي المدخل ✓ خيارات مرنة من البادئات ✓ بروتوكول قصير ✓ مؤشر تتبع مرئي ✓ درجة حرارة تفاعل أعلى ✓ حجم أكبر من الحمض النووي الريبوزي المدخل ✓ خيارات مرنة من البادئات ✓ كل شيء متضمن اتبع شجرة القرار أدناه لاختيار مجموعة تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) للسلسلة الأولى بناءً على تطبيقاتك اللاحقة. الشكل ١. يدعم مزيج LunaScript RT Master Mix (بدون بادئات) العديد من التطبيقات. بإضافة بادئات مختلفة، بما في ذلك مزيج البادئات العشوائي، وd(T)23VN، والسداسيات العشوائية، يمكن أن يكون الحمض النووي التكميلي (cDNA) الناتج بواسطة مزيج LunaScript RT Master Mix مناسبًا تمامًا للتطبيقات اللاحقة مثل الكشف بتقنية RT-qPCR، وRT-PCR، ودراسات تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq). س: عند استخدام منتجات الحمض النووي التكميلي (cDNA) من LunaScript في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) اللاحق (أي تفاعل البلمرة المتسلسل العكسي ثنائي الخطوات)، ما هي الأحجام ومنتجات تفاعل البلمرة المتسلسل التي يمكن استخدامها؟ ج: منتجات الحمض النووي التكميلي (cDNA) من تفاعلات LunaScript متوافقة مع العديد من كواشف تفاعل البلمرة المتسلسل. عادةً، نوصي باستخدام OneTaq 2X Master Mix (NEB #M0482 أو NEB #M0485) للكشف عن الحمض النووي التكميلي (PCR) حتى 5 كيلوبايت، وQ5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix (NEB #M0494) للحصول على أعلى دقة، وLongAmp Taq 2X Master Mix (NEB #M0287) للحصول على إنتاجية عالية من منتجات أطول. اعتمادًا على الأهداف/البادئات، قد يختلف حجم الحمض النووي التكميلي (cDNA) الأمثل ويجب تحسينه، ولكن عادةً، نوصي باستخدام 1 ميكرولتر من تفاعل الحمض النووي التكميلي (cDNA) كمدخل في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) بحجم 25 ميكرولتر. عند الحاجة، يمكن إضافة ما يصل إلى 20% من حجم تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) (مثلاً، 5 ميكرولتر من ناتج الحمض النووي المكمل cDNA في تفاعل PCR بحجم 25 ميكرولتر). س: هل يمكنني استخدام LunaScript RT SuperMix في سير عمل تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq)؟ ج: يحتوي LunaScript RT SuperMix على كلٍ من الهيكسامرات العشوائية وأوليغومرات dT، مما يوفر تغطية متساوية لقوالب الحمض النووي الريبوزي. وقد استُخدم في التسلسل الجينومي لفيروس SARS-CoV-2 باتباع مجموعة متنوعة من البروتوكولات، بما في ذلك تلك الخاصة بشبكة ARTIC. تتوفر محاليل كاملة التجهيز في منتجات NEB التالية: NEB #E7660، NEB# E7658، NEB #E7560. س: كيف أختار بين مجموعة LunaScript® RT SuperMix ومجموعات ProtoScript لتخليق الحمض النووي المكمل cDNA من السلسلة الأولى؟ ج: تحتوي مجموعات تخليق الحمض النووي المكمل cDNA من السلسلة الأولى على إنزيمات نسخ عكسي مختلفة، وتتمثل الاختلافات الرئيسية في تطبيقاتها الأساسية وشكلها ودرجة حرارة التفاعل. إليكم ملخصًا لمجموعات تركيب الحمض النووي التكميلي (cDNA) الثلاثة الخاصة بنا. مجموعة LunaScript RT SuperMix (E3010) مجموعة ProtoScript II لتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) من السلسلة الأولى (E6560) مجموعة ProtoScript لتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) من السلسلة الأولى (E6300) إنزيم النسخ العكسي RT Luna إنزيم النسخ العكسي ProtoScript II إنزيم النسخ العكسي M-MuLV التنسيق Supermix مزيج التفاعل، مزيج الإنزيم، البادئ مزيج التفاعل، مزيج الإنزيم، البادئ التطبيق الأساسي RT-qPCR ثنائي الخطوات نقطة النهاية RT-PCR حتى 10 كيلوبايت نقطة النهاية RT-PCR حتى 5 كيلوبايت التطبيق الثانوي نقطة النهاية RT-PCR حتى 3 كيلوبايت RT-qPCR ثنائي الخطوات RT-qPCR ثنائي الخطوات درجة حرارة التفاعل حتى 65 درجة مئوية (55 درجة مئوية مثالية) حتى 48 درجة مئوية (42 درجة مئوية مثالية) حتى 45 درجة مئوية (42 درجة مئوية مثالية) مدخلات الحمض النووي الريبي (RNA) من 1 ميكروغرام إلى 1 بيكوغرام من 1 ميكروغرام إلى 1 بيكوغرام من 1 ميكروغرام إلى حضانة 1 بيكوغرام: 25 درجة مئوية لمدة دقيقتين، 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة، 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ميزات إضافية: صبغة تتبع زرقاء، بروتوكول سريع لمدة 13 دقيقة. س: كيف أختار بين إنزيم النسخ العكسي إندورو ومنتجات لونا سكريبت وبروتو سكريبت المختلفة؟ ج: إنزيم النسخ العكسي إندورو هو إنزيم نسخ عكسي مشفر بواسطة إنترون من المجموعة الثانية، وهو مفيد لتخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) من النسخ الطويلة، والحمض النووي الريبوزي (RNA) ذي البنية الثانوية القوية، وعينات الحمض النووي الريبوزي (RNA) التي تحتوي على مثبطات. في المقابل، كواشف لونا سكريبت عبارة عن مخاليط رئيسية. مجموعة لونا سكريبت RT ماستر ميكس (خالية من البادئات) (NEB #E3025) مناسبة لتخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) بشكل عام. منتجات LunaScript RT SuperMix (NEB #E3010/M3010) مُحسّنة لسير عمل RT-qPCR ثنائي الخطوات، حيث لا تتطلب سوى منتجات cDNA قصيرة. كما تُستخدم LunaScript RT SuperMix في سير عمل تسلسل ARTIC SARS-CoV-2. يوضح هذا الجدول تطبيقات وميزات كل منتج. منتجات النسخ العكسي الفيروسي الرجعي المشفر بالإنترونات: إنزيم النسخ العكسي Induro™ (NEB #M0681)، مجموعة LunaScript® RT SuperMix (NEB #E3010)، مجموعة LunaScript RT SuperMix (NEB #M3010)، مجموعة LunaScript RT Master Mix (NEB #E3025)، مجموعة ProtoScript® II لتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) من السلسلة الأولى (NEB #E6560). التطبيقات: تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) الطويل، عينات الحمض النووي الريبوزي (RNA) غير النقية، تطبيقات تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq) (مثل التسلسل المباشر للحمض النووي الريبوزي، وتسلسل الحمض النووي التكميلي (cDNA) طويل القراءة، وتسلسل الحمض النووي الريبوزي الناقل (tRNA seq)، الكشف عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR) على مرحلتين، بروتوكول قصير. ✓ خيارات مرنة من البادئات، و dNTPs المعدلة ✓ درجة حرارة تفاعل أعلى ✓ مزيج فائق ✓ بروتوكول قصير ✓ صبغة تتبع ✓ درجة حرارة تفاعل أعلى ✓ خيارات مرنة من البادئات ✓ بروتوكول قصير ✓ صبغة تتبع ✓ درجة حرارة تفاعل أعلى ✓ خيارات مرنة من البادئات ✓ تتضمن المجموعة جميع المكونات اللازمة. س: كيف أعرف ما إذا كان قالب الحمض النووي الريبوزي (RNA) الخاص بي ذو جودة جيدة؟ ج: يُعد الحمض النووي الريبوزي (RNA) السليم عالي النقاء ضروريًا لتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) كامل الطول. تشير نسبة الامتصاص عند A260/A280 التي تزيد عن 1.7 أو رقم RIN أكبر من 8 على جهاز BioAnalyzer عادةً إلى جودة عالية للحمض النووي الريبوزي (RNA).