نيو إنجلاند بيولابس، M3019S، مزيج Luna® Probe One-Step RT-qPCR 4X مع UDG

يُمكّن مزيج Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X مع UDG من الكشف الحساس عن تسلسلات الحمض النووي الريبوزي (RNA) المستهدفة، مع أداء قوي في تطبيقات متعددة تصل إلى 5 أهداف. يتوفر هذا المنتج أيضًا ضمن فئات ذات صلة: تطبيقات Luna® qPCR وRT-qPCR، وqPCR وRT-qPCR، وRT-qPCR ثنائي الخطوة. الأسئلة الشائعة : س: كيف أستخدم qPCR لتحديد تركيز المادة؟ ج: يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) التألق في الوقت الحقيقي لقياس كمية الحمض النووي (DNA) الموجودة في كل دورة أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل. طُوّرت مجموعة واسعة من الطرق لتوليد إشارة فلورية، وأكثرها شيوعًا استخدام مجسات التحلل المائي (مثل TaqMan®)، أو صبغة ربط الحمض النووي ثنائي السلسلة (مثل SYBR® Green). عند النقطة التي يمكن فيها اكتشاف إشارة التألق لـ qPCR فوق تألق الخلفية، يمكن تحديد دورة التحديد الكمي، أو قيمة Cq. يمكن استخدام قيم Cq لتقييم وفرة الهدف النسبية بين عينتين أو أكثر. كما يمكن استخدامها لحساب الكميات المطلقة للهدف بالرجوع إلى منحنى معياري مناسب، مُستمد من سلسلة من تخفيفات الحمض النووي المعروفة. عادةً، يقوم برنامج جهاز qPCR بإجراء عمليات الرسم والحسابات اللازمة لتحديد التركيز. بدلاً من ذلك، تتضمن أدوات NEB الإلكترونية حاسبة qPCR، والتي يمكن العثور عليها على NEBiocalculator.neb.com. س: هل يمكنني إعداد جهاز Luna® RT-qPCR في درجة حرارة الغرفة؟ ج: نعم. يمكن إعداد جهاز Luna RT-qPCR في درجة حرارة الغرفة، ولكن للحصول على أفضل النتائج، يجب حفظ التفاعلات على الجليد قبل دورات التضخيم الحراري. يتم التحكم في كلا الإنزيمين الموجودين في المجموعة، وهما Hot Start Taq DNA Polymerase و WarmStart® Luna Reverse Transcriptase، بواسطة مثبطات عكسية حساسة للحرارة (SOMAmer®). تُثبّط هذه الـ SOMAmers نشاط البوليميراز عند درجات حرارة أقل من 45 درجة مئوية، مما يمنع النشاط غير المرغوب فيه وغير النوعي حتى يتم تسخين التفاعل فوق درجة حرارة الإطلاق خلال خطوة النسخ العكسي. س: هل يجب عليّ استخدام الكشف القائم على المجس أم الكشف القائم على الصبغة في فحوصات qPCR؟ ج: يتطلب الكشف القائم على الصبغة (مثل SYBR® Green) إضافة بادئات PCR فقط، مما يجعله خيارًا اقتصاديًا لـ qPCR. مع ذلك، ستكشف الصبغة المتداخلة عن أي dsDNA مُنتَج في التفاعل. لذلك، قد يُلاحَظ تضخيم خارج الهدف وتضخيم غير قالب (NTC) لبعض مجموعات البادئات، مما يؤدي إلى قياس كمي غير دقيق. يمكن استخدام منحنيات التمسخ (الذوبان) التي تُجرى بعد PCR للتمييز بين المنتجات الصحيحة وغير النوعية. بالإضافة إلى ذلك، لا يمكن قياس سوى مُضخَّم واحد في qPCR القائم على الصبغة، ولا توجد إمكانية لإجراء تفاعلات متعددة. يتطلب الكشف القائم على المجسات تصميمَ والحصولَ على مجسٍّ أوليغونوكليوتيدي مُوسَم بفلوروفور مُحدد التسلسل، بالإضافة إلى بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) التقليدية. يزيد هذا من تكاليف التحليل، لكن تجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) القائمة على المجسات تتميز بدقة عالية جدًا، ومن غير المرجح أن تؤدي إلى قياس كمي غير دقيق بسبب تضخيم NTC. تُعدّ التفاعلات المتعددة ممكنة باستخدام المجسات، حيث يمكن تصميم مُضخَّمات مختلفة باستخدام فلوروفورات فريدة وفقًا للإمكانيات البصرية لجهاز qPCR. س: كيف يُمكنني تصميم البادئات لـ Luna® qPCR؟ ج: نوصي باستخدام برنامج تصميم البادئات (مثل Primer3) لاختيار تسلسلات الهدف والبادئات لزيادة كفاءة التضخيم إلى أقصى حد مع تقليل التضخيم غير النوعي وثنائيات البادئات. يتوافق Luna qPCR أيضًا مع فحوصات qPCR المتوفرة تجاريًا. في حال تصميم البادئات يدويًا، نشجع على تصميم مُضخَّمات قصيرة (من 70 إلى 200 زوج قاعدي) ذات محتوى GC متوازن (40-60%). استهدف درجة حرارة انصهار (Tm) تقارب 60 درجة مئوية باستخدام إعدادات Hot Start Taq في حاسبة Tm من NEB (TmCalculator.neb.com). بالنسبة لأهداف cDNA وRNA، يُنصح بتصميم البادئات عبر مواقع الربط المعروفة (وصلات الإكسون-إكسون) لمنع التضخيم من الحمض النووي الجينومي. س: ما هو طول ناتج التضخيم المناسب لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR)؟ ج: من العوامل المهمة في تجربة qPCR زيادة كفاءة تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل، وتساعد نواتج التضخيم القصيرة على ضمان كفاءة عالية. يتراوح طول نواتج التضخيم النموذجية لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي بين 70 و200 زوج قاعدي، ونوصي بتصميم هدفك ضمن هذا النطاق. يمكن استخدام نواتج تضخيم أطول، ولكن قد يتطلب ذلك تحسينًا (مثل زيادة أوقات التمديد). س: لماذا لون مزيج Luna® qPCR أزرق؟ هل ستتداخل هذه الصبغة مع الكشف؟ ج: يحتوي مزيج Luna qPCR على صبغة مرجعية بصرية خاملة تُعطي المزيج لونًا أزرقًا واضحًا. يُسهّل هذا اللون تحديد الآبار التي تم تحميلها بالكواشف في لوحة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR)، وهو أمرٌ قد يكون صعبًا نظرًا لصغر حجم الآبار وطبيعة العديد من لوحات qPCR ذات 96 و384 بئرًا غير الشفافة. وقد خضع الصبغ الأزرق لتقييمات مكثفة في تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR)، وهو لا يُعيق أو يُؤثر على كشف qPCR. س: هل يُمكنني تشغيل مزيج Luna® qPCR على جهاز qPCR الخاص بي؟ ج: تحتوي مزيجات Luna qPCR التالية على صبغة مرجعية سلبية شاملة تُتيح التوافق مع مجموعة واسعة من أجهزة الوقت الحقيقي، بما في ذلك تلك التي لا تستخدم صبغة مرجعية سلبية للتطبيع (مثل Bio-Rad® CFX)، أو تلك التي تستخدم صبغة مرجعية سلبية منخفضة التركيز (مثل Applied Biosystems® 7500 أو QuantStudio®)، أو تلك التي تستخدم صبغة مرجعية سلبية عالية التركيز (مثل Applied Biosystems 7900 أو StepOne®). مزيج Luna Universal qPCR Master Mix (NEB #M3003) ومزيج Luna Universal Probe qPCR Master Mix (NEB #M3004) ومجموعة Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit (NEB #E3005) ومجموعة Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit (NEB #E3006) ومزيج Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix with UDG (NEB #M3019) ومزيج LyoPrime Luna Probe One-Step RT-qPCR Mix with UDG (NEB #L4001). تفتقر مجموعة Luna Probe One-Step RT-qPCR Kit (No ROX) (NEB #E3007) ومجموعة Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix with UDG (No ROX) (NEB #M3029) إلى صبغة مرجعية ويمكن استخدامها مع أي جهاز لا يتطلب معايرة ROX. يرجى الرجوع إلى تعليمات الشركة المصنعة للجهاز لمزيد من التفاصيل. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام مزيج Luna مع ظروف دورات قياسية أو سريعة. س: هل يمكنني استخدام إعدادات الجهاز السريعة مع مزيج Luna® qPCR؟ ج: يتوافق مزيج Luna qPCR مع سرعات التسخين السريعة والقياسية على الأجهزة التي تدعم كلا السرعتين. نوصي بدرجات حرارة وأوقات دورات محددة (راجع البروتوكول أو الدليل لمزيد من المعلومات)، ولكن يمكن استخدام أي من إعدادات التسخين مع ظروف الدورات هذه. (ملاحظة: يجب التحقق من ظروف الدورات بعد تغيير إعداد سرعة التسخين؛ في بعض أجهزة الوقت الحقيقي، سيؤدي تغيير سرعة التسخين أيضًا إلى إعادة ظروف الدورات إلى الإعداد الافتراضي للجهاز). س: هل أحتاج إلى إضافة ROX؟ ج: توصي بعض أجهزة الوقت الحقيقي باستخدام صبغة مرجعية سلبية (عادةً ROX) للتغلب على الاختلافات بين الآبار التي قد تنتج عن قيود الجهاز مثل "تأثير الحافة" والفقاعات والاختلافات الطفيفة في الحجم والتألق الذاتي من الغبار أو الجسيمات في التفاعل. مع ذلك، لا يُسهم توحيد ROX إلا ​​قليلاً في معالجة التباينات الناتجة عن أخطاء سحب القوالب/البادئات، والخلط غير المتجانس، ومشاكل التبخر/التكثيف. تحتوي منتجات Luna® qPCR التالية على صبغة مرجعية سلبية شاملة تُمكّن من التوافق مع مجموعة متنوعة من أجهزة الوقت الحقيقي، بما في ذلك تلك التي لا تستخدم توحيدًا مرجعيًا سلبيًا وتلك التي تستخدم كمية منخفضة أو عالية من الصبغة المرجعية السلبية (ROX). مزيج Luna Universal qPCR Master Mix (NEB #M3003) ومزيج Luna Universal Probe qPCR Master Mix (NEB #M3004) ومجموعة Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit (NEB #E3005) ومجموعة Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit (NEB #E3006) ومزيج Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix with UDG (NEB #M3019) ومزيج LyoPrime Luna Probe One-Step RT-qPCR Mix with UDG (NEB #L4001) ومجموعة Luna Probe One-Step RT-qPCR Kit (No ROX) (NEB #E3007) ومزيج Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix with UDG (No ROX) (NEB #M3029) تفتقر إلى صبغة مرجعية ويمكن استخدامها مع أي جهاز لا يتطلب معايرة ROX. يرجى الرجوع إلى تعليمات الشركة المصنعة للجهاز لمزيد من التفاصيل. أجهزة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR): Bio-Rad® iQ™5، CFX96، CFX384، Opticon Roche Lightcycler®، Qiagen Rotor-Gene™، Eppendorf Mastercycler®، Cepheid® SmartCycler® (غير موصى به/غير مطلوب)، Applied Biosystems® 7500، 7500 Fast، QuantStudio™، ViiA7™، Agilent Mx™ (تركيز منخفض ROX ~50 نانومتر نهائي)، Applied Biosystems® 5700، 7000، 7300، 7700، 7900، 7900HT، 7900HT Fast، StepOne™، StepOnePlus™ (تركيز عالٍ ROX ~500 نانومتر نهائي). س: ما هي عينات الحمض النووي الريبوزي (RNA) التي يمكن استخدامها في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي (RT-qPCR) مع مزيج Luna®؟ ج: للحصول على أفضل النتائج، نوصي باستخلاص أو تنقية مادة الحمض النووي الريبوزي (RNA) الأولية. تعمل مجموعة Luna RT-qPCR مع الأحماض النووية المستخلصة من أنواع مختلفة من العينات، والتي يتم تنقيتها باستخدام طرق الاستخلاص التقليدية القائمة على الأعمدة (مثل مجموعة Monarch® RNA Miniprep Kit (NEB #T2010)). عند إجراء الدراسات باستخدام مزارع الخلايا الثديية، يمكن إضافة مستخلصات الخلايا الناتجة عن وحدة Luna Cell Ready Lysis Module (NEB #E3032) إلى جميع كواشف Luna RT-qPCR أحادية الخطوة. بالإضافة إلى ذلك، أثبتت العديد من الدراسات بشكل مباشر توافق كواشف Luna مع اللعاب وعينات أخرى ذات صلة سريرية باستخدام بروتوكولات تحضير العينات الأولية. يُعد SalivaDirect مثالًا على ذلك. س: ما هي كمية البادئ والمسبار التي يجب استخدامها مع مزيج Luna® Universal Probe qPCR Master Mix؟ ج: بالنسبة لمعظم الأهداف، يوفر التركيز النهائي 400 نانومتر لكل بادئ و200 نانومتر للمسبار الأداء الأمثل. إذا لزم الأمر، يمكن ضبط تركيز البادئ النهائي بين 200 و900 نانومتر، وتركيز المجس النهائي بين 100 و500 نانومتر. س: هل يمكنني استخدام أوقات دورات أقصر؟ ج: نعم. بالنسبة للعديد من الأهداف، يمكن استخدام أوقات حضانة أقصر في كل خطوة. مع ذلك، يُنصح باستخدام ظروف الدورات القياسية كنقطة بداية، وقد تكون ضرورية للاختبارات المعقدة، مثل تلك التي تتطلب كمية قليلة من الحمض النووي. س: ما كمية قالب الحمض النووي الريبوزي (RNA) التي يجب استخدامها في تفاعل RT-qPCR؟ ج: تعمل مجموعة Luna® Universal One-Step RT-qPCR Kit بكفاءة مع قوالب الحمض النووي الريبوزي (RNA) المنقاة، بما في ذلك الحمض النووي الريبوزي الكلي، والحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA)، وعينات النسخ المختبرية. الكمية في تفاعل حجمه 20 ميكرولتر: إجمالي الحمض النووي الريبي ≤ 1 ميكروغرام، الحمض النووي الريبي متعدد الأدينين ≤ 0.1 ميكروغرام، النسخ المتماثلة في المختبر ≤ 10⁹ نسخة. س: هل يمكنني إجراء تفاعلات متعددة باستخدام مجموعات Luna® Probe One-Step RT-qPCR؟ هل أحتاج إلى تغيير ظروف التفاعل؟ ج: نعم، لقد تم بنجاح إجراء تفاعلات متعددة لتضخيم ما يصل إلى 5 أهداف باستخدام مجموعات Luna Universal Probe RT-qPCR. اختر الفلوروفورات المختلفة التي تتوافق مع قنوات الكشف المنفصلة لجهاز الوقت الحقيقي. يجب اختبار كل هدف في تفاعل أحادي أولاً. لكل منتج تضخيم، ابدأ بإضافة 400 نانومتر من البادئ الأمامي والخلفي و200 نانومتر من المجس في كل تفاعل. إذا لوحظ تدهور في أداء منتج تضخيم معين عند استخدامه في فحص متعدد مقارنةً بنتائجه في الفحص الأحادي، فقد تتطلب التفاعلات تحسينًا. قد يكون من المفيد تقليل تركيز البادئات للأهداف الوفيرة أو ذات النسخ الكثيرة، و/أو زيادة تركيزها للأهداف قليلة الوفرة أو ذات النسخ القليلة. قد يلزم إجراء المزيد من التحسين مع ازدياد تعدد التفاعلات، باستخدام المعايير التالية كإرشادات: تركيز البادئات 100-900 نانومتر، وتركيز المجس 100-500 نانومتر. مثال على تفاعل ثلاثي باستخدام مجموعة Luna Universal One-Step RT-qPCR Probe Kit على جهاز Applied Biosystems™ 7500 Fast: س: هل يمكنني استخدام مجس موسوم بـ ROX مع مزيج Luna® Probe Mixes الذي يحتوي على صبغة مرجعية عالمية ROX؟ ج: نعم. مع ذلك، يجب مراعاة متطلبات التطبيع المرجعي السلبي لجهاز الوقت الحقيقي. بالنسبة للأجهزة التي لا تستخدم تطبيع ROX، يمكن عمومًا استخدام مجس ROX دون قلق أو تعديل للجهاز. أما بالنسبة للأجهزة التي تستخدم ROX للتطبيع، فلا يُنصح عادةً باستخدام مجسات ROX، وهذا الخيار غير متاح في إعدادات الجهاز النموذجية. لا يزال من الممكن استخدام مجسات ROX بشرط إيقاف خاصية معايرة ROX، ولكن ستُفقد فوائد هذه الخاصية. للحصول على مزيج خالٍ من ROX، يُرجى الاطلاع على مجموعة Luna Probe One-Step RT-qPCR Kit (بدون ROX) (NEB# E3007) أو مجموعة Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix with UDG (بدون ROX) (NEB #M3029)، أو التواصل عبر البريد الإلكتروني info@neb.com. س: هل يمكن استخدام استراتيجيات كشف بديلة تعتمد على المجسات مع مزيج Luna® Probe Mix؟ ج: نعم. لقد تم اختبار كل من Molecular beacon وScorpions® بنجاح مع مزيج مجسات Luna. كما يُمكن استخدام تصميمات مجسات أخرى بشرط توافقها مع نشاط إنزيم Hot Start Taq DNA Polymerase من نوع 5´→3´. س: ما هي درجة الحرارة المناسبة لتخليق cDNA باستخدام مجموعات Luna® RT-qPCR؟ ج: يدعم إنزيم النسخ العكسي Luna WarmStart® المقاوم للحرارة تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) بكفاءة عالية عند درجات حرارة مرتفعة مقارنةً بإنزيم MMLV. بشكل عام، يمكن إتمام تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) بحضانة لمدة 10 دقائق عند 55 درجة مئوية. بالنسبة للقوالب الصعبة، يمكن رفع درجة حرارة تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) إلى 60 درجة مئوية. س: هل يمكنني استخدام أهداف أطول في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي أحادي الخطوة (RT-qPCR)؟ ج: بشكل عام، تميل المضخمات الأصغر (70-200 زوج قاعدي) إلى تحقيق كفاءة أعلى وقيم عتبة (Cq) مبكرة. بالنسبة للأهداف في هذا النطاق الحجمي، يُوصى بوقت تمديد لمدة 30 ثانية. ستستفيد الأهداف الأطول من أوقات تمديد أطول، ولكن الوقت الفعلي سيعتمد على طول الهدف ونوع الجهاز، ويجب تحديده تجريبيًا. س: هل مجموعة Monarch® Total RNA Miniprep Kit متوافقة مع كواشف Luna® RT-qPCR؟ ج: نعم. يمكن استخدام الحمض النووي الريبوزي (RNA) المُنقّى باستخدام هذه المجموعات في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي (RT-qPCR) مع جميع مجموعات Luna One-Step RT-qPCR من NEB ومنتجات LunaScript® RT. يُنتج تفاعل RT-qPCR للحمض النووي الريبوزي المُنقّى باستخدام Monarch من أنواع عينات مختلفة نتائج عالية الجودة باستمرار، مما يسمح بالقياس الكمي الدقيق والقابل للتكرار. ولإثبات جودة وفائدة Monarch Total RNA للقياس الكمي القائم على RT-qPCR، أُجريت 16 تجربة وتم تصويرها باستخدام طريقة "النقاط داخل المربعات" التي طُوّرت في NEB. تشمل كل تجربة ثلاث تفاعلات متكررة لنطاق خمسة لوغاريتمات من تركيزات القالب المُدخل وعينات تحكم سلبية (NTC) (18 تفاعلًا إجمالًا). تُعرَّف تجربة RT-qPCR عالية الجودة، والمُمثَّلة بنقطة داخل المربع، بأنها ذات كفاءة تتراوح بين 90 و110%، وقيمة ΔCq ≥ 3 (حيث ΔCq هو الفرق بين متوسط ​​قيمة Cq لعينة التحكم السلبية (NTC) وأقل قيمة مُدخلة)، ودرجة جودة ≥ 4 (بناءً على الخطية، وقابلية التكرار، وشكل المنحنى، ومعايير أخرى). استُخدمت بادئات تستهدف متغيرات GAPDH (في الجرذان والفئران والطماطم والخميرة)، ومتغيرات PGK (في الجرذان)، ومتغيرات β-actin (في الجرذان والفئران والطماطم) مع الحمض النووي الريبوزي الكلي المُستخلص من دماغ الجرذان وكبدها وكليتيها، وأوراق الطماطم، والخميرة كقوالب. جُمعت فحوصات RT-qPCR وفقًا للتعليمات باستخدام كواشف Luna RT-qPCR، وأُجريت دوراتها على جهاز Bio-Rad CFX384. يُنتج تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي (RT-qPCR) على الحمض النووي الريبوزي (RNA) المُنقّى بتقنية Monarch منحنيات qPCR عالية الجودة، مما يُظهر دقة القياس الكمي عبر مجموعة واسعة من أنواع العينات. تم تخفيف الحمض النووي الريبوزي المُنقّى بتقنية Monarch من دم الإنسان الكامل، وكلى الفئران، وأوراق الطماطم، وخميرة S. cerevisiae لإنتاج نطاق لوغاريتمي من تركيزات القالب المُدخل. استُخدمت بادئات تستهدف متغيرات GAPDH (الطماطم، الخميرة)، أو PGK (الفئران)، أو SMG1 (دم الإنسان) في فحوصات RT-qPCR، وتم تجميعها وفقًا للتعليمات باستخدام كواشف Luna RT-qPCR (NEB #E3005) وتم تدويرها على جهاز Bio-Rad CFX384. س: هل مجموعات تنظيف الحمض النووي الريبوزي (RNA) بتقنية Monarch Spin متوافقة مع كواشف Luna RT-qPCR؟ ج: نعم. يمكن استخدام الحمض النووي الريبوزي (RNA) المُنقّى بهذه المجموعات في تفاعل RT-qPCR مع جميع مجموعات Luna One-Step RT-qPCR من NEB ومنتجات LunaScript® RT. س: ما هي الاختلافات بين منتجات Luna One-Step RT-qPCR (NEB #E3006، #E3007، #M3019، #M3029، و#L4001)؟ ج: جميع منتجات Luna هذه مُحسَّنة لإجراء تفاعل RT-qPCR بخطوة واحدة باستخدام الكشف عن المجسات. NEB #M3019/#M0329 عبارة عن مزيج رئيسي 4X في أنبوب واحد. يحتوي منتجا NEB #E3006/#E3007 على أنابيب منفصلة لمزيج التفاعل 2X ومزيج الإنزيم 20X. كما يحتوي المنتج M3019 على dUTP بالإضافة إلى UDG حساس للحرارة، لضمان منع التلوث المتبقي. NEB #L4001 هو نسخة مجففة بالتجميد من NEB#M3019، وهو متوفر في قوارير أو صفائح 96 بئراً. يفتقر كل من NEB #E3007 و#M3029 إلى صبغة مرجعية سلبية ROX عالمية. تختلف الخلطات المتاحة من حيث الشكل ودرجة حرارة التخزين وإضافة إنزيم UDG الحساس للحرارة لمنع التلوث المتبقي، كما هو موضح في الجدول أدناه. NEB #M3019 Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix with UDG NEB #M3029 Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix with UDG (No ROX) NEB #E3006 Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit NEB #E3007 Luna Probe One-Step RT-qPCR Kit (No ROX) NEB #L4001 LyoPrime Luna Probe One-Step RT-qPCR Mix with UDG Format 4X Master Mix 4X Master Mix 2X Reaction Mix 20X Enzyme Mix 2X Reaction Mix 20X Enzyme Mix Lyophilized Master Mix; إعادة الترطيب بمعدل 2-4 أضعاف. منع التلوث المتبقي متضمن. نعم (يشمل dUTP وUDG غير المستقر حراريًا). نعم (يشمل dUTP وUDG غير المستقر حراريًا). لا (يشمل dUTP؛ يتطلب إضافة UDG). لا (يشمل dUTP؛ يتطلب إضافة UDG). نعم (يشمل dUTP وUDG غير المستقر حراريًا). صبغة التطبيع (ROX عالمي). نعم، نعم، نعم، نعم. تعدد الإرسال: نعم (حتى 5 إرسالات). نعم (حتى 5 إرسالات). نعم (حتى 5 إرسالات). نعم (حتى 5 إرسالات). نعم (حتى 5 إرسالات). الحد الأقصى لحجم العينة (20 ميكرولتر من تفاعل RT-qPCR): حتى 10 ميكرولتر. حتى 10 ميكرولتر. حتى 8 ميكرولتر. حتى 8 ميكرولتر. حتى 10 ميكرولتر. ظروف التدوير القياسية: 25 درجة مئوية لمدة 30 ثانية (معالجة UDG)؛ 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق؛ 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. ٤٥ دورة من ٩٥ درجة مئوية لمدة ١٠ ثوانٍ، و٦٠ درجة مئوية لمدة ٣٠ ثانية، و٢٥ درجة مئوية لمدة ٣٠ ثانية (معالجة UDG)؛ ٥٥ درجة مئوية لمدة ١٠ دقائق؛ ٩٥ درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة؛ ٤٥ دورة من ٩٥ درجة مئوية لمدة ١٠ ثوانٍ، و٦٠ درجة مئوية لمدة ٣٠ ثانية. ٥٥ درجة مئوية لمدة ١٠ دقائق؛ ٩٥ درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة؛ ٤٥ دورة من ٩٥ درجة مئوية لمدة ١٠ ثوانٍ، و٦٠ درجة مئوية لمدة ٣٠ ثانية. ٥٥ درجة مئوية لمدة ١٠ دقائق؛ ٩٥ درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة؛ ٤٥ دورة من ٩٥ درجة مئوية لمدة ١٠ ثوانٍ، و٦٠ درجة مئوية لمدة ٣٠ ثانية. ٢٥ درجة مئوية لمدة ٣٠ ثانية (معالجة UDG)؛ ٥٥ درجة مئوية لمدة ١٠ دقائق؛ ٩٥ درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة؛ ٤٥ دورة عند ٩٥ درجة مئوية لمدة ١٠ ثوانٍ، و٦٠ درجة مئوية لمدة ٣٠ ثانية. درجة حرارة التخزين: -٢٠ درجة مئوية. درجة حرارة الغرفة (من ١٥ إلى ٢٥ درجة مئوية). س: توصي شركات أخرى بفترة حضانة لمدة دقيقتين عند ٢٥ درجة مئوية لمنع التلوث المتبقي، فهل تكفي فترة حضانة لمدة ٣٠ ثانية عند ٢٥ درجة مئوية؟ ج: نعم، نظرًا للنشاط القوي لإنزيم UDG الحساس للحرارة من NEB، نلاحظ تحلل ما يصل إلى ١٠٠,٠٠٠ نسخة تقريبًا من عينة التلوث الوهمية باستخدام فترة حضانة لمدة ٣٠ ثانية عند ٢٥ درجة مئوية. وبما أن التلوث المتبقي عادةً ما يشمل كميات أقل بكثير من المدخلات، فلا داعي لتمديد فترة الحضانة. س: كيف يمكنني إجراء اختبار تحكم بدون وقت حضانة؟ ج: لإعداد ضوابط بدون إنزيم النسخ العكسي، خذ جزءًا من M3019 وحضّنه عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ستؤدي هذه الخطوة إلى تعطيل إنزيم النسخ العكسي Luna WarmStart وإنزيم UDG الحساس للحرارة. ثم استخدم M3019 المعالج لإعداد تفاعلات ضوابط بدون إنزيم النسخ العكسي، وقم بإجراء نفس ظروف التدوير المستخدمة مع العينات الأخرى. تشير قيم Cq الموجبة التي تزيد عن 40 إلى احتمال تلوث الحمض النووي. س: هل يمكنني استخدام مزيج Luna Probe RT-qPCR للكشف عن الفيروسات؟ ج: نعم، مزيج Luna Probe RT-qPCR مناسب بشكل خاص لتمكين الكشف الحساس عن الأهداف الفيروسية، بما في ذلك الكشف عن فيروس SARS-CoV-2. يمكن الاطلاع على أمثلة لكيفية استخدام Luna ومنتجات أخرى على صفحة أبحاث COVID-19 الخاصة بنا.