نيو إنجلاند بيولابس، M5505L، إنزيم USER®

تمت إعادة صياغة إنزيم USER باستخدام الألبومين المؤتلف (rAlbumin) بدءًا من رقم الدفعة 10233215. الفئات ذات الصلة: إنزيمات إصلاح الحمض النووي وإنزيمات النوكلياز الداخلية المتخصصة بالبنية. التطبيقات : تطبيقات إنزيمات USER® و USER II الحساسة للحرارة، USER®، الاستنساخ، تجميع الحمض النووي واستنساخه، تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لقطع 10 بيكومول من جزيء أوليغونوكليوتيد مزدوج مكون من 34 قاعدة يحتوي على قاعدة يوراسيل واحدة، في 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مولار أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار أسيتات التريس، 10 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 10 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 5 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار داي ثيو ثريتول، 0.1 ملي مولار إيديتات ثنائي الصوديوم، 175 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب، 50% جلسرين، 50 ملي مولار كلوريد البوتاسيوم، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري: لا. الأسئلة الشائعة : س: هل سيعمل إنزيم المستخدم في محلول rCutSmart؟ ج: نعم، سيعمل إنزيم المستخدم في محلول rCutSmart. للاطلاع على نسبة نشاطه الوظيفي في rCutsmart، ونسبة نشاط إنزيمات تعديل الحمض النووي الأخرى في عملية الاستنساخ، يُرجى الرجوع إلى مخطط نشاط إنزيمات تعديل الحمض النووي في محلول rCutSmart®. س: أين يمكنني العثور على معلومات أو بروتوكول للاستنساخ باستخدام إنزيم USER®؟ ج: https://www.neb.com/applications/cloning-and-synthetic-biology/user-cloning س: أثناء تحضير مكتبة NEBNext DNA، ما الإنزيم الذي يقطع محولات حلقات الحمض النووي NEBNext والحلقات أحادية السلسلة المحتوية على اليوراسيل؟ ج: يتكون إنزيم USER من UDG وإنزيم Endonuclease VIII. يساعد UDG في إنشاء فجوة عند موقع اليوراسيل، وينتقل إنزيم Endonuclease VIII إلى ذلك الموقع ويقطع العمود الفقري الفوسفودايستري عند طرفي 3' و5'، مُحررًا ديوكسي ريبوز خاليًا من القاعدة. س: هل يمكنك إخباري المزيد عن التحول من الألبومين البقري المصل (BSA) إلى الألبومين المُعاد تركيبه (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ ج: يسرّ شركة NEB أن تعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على الألبومين البقري المصل (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1، وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1، وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المُعاد تركيبه. ونعتقد أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونقدم هذا التحسين بنفس السعر. س: ما الفرق بين مجموعة إنزيمات USER® (#M5505، #M5508، #M5509) وإنزيم Endonuclease Q المقاوم للحرارة (#M0701)؟ ج: منتجات USER (إنزيم USER (#M5505)، وإنزيم USER II غير المستقر حراريًا (#M5508)، وإنزيم USER III المستقر حراريًا (#M5509)) عبارة عن مزيج من إنزيمين: UDG وإنزيم نوكلياز داخلي. في المقابل، إنزيم نوكلياز Q المستقر حراريًا (#M0701) هو إنزيم واحد. على الرغم من أن إنزيمات USER وإنزيم نوكلياز Q المستقر حراريًا يتعرفان على ديوكسي يوراسيل في ركائز الحمض النووي ويقطعانه، إلا أن النواتج الناتجة مختلفة. النواتج النهائية لإنزيمات USER هي فجوات أحادية النوكليوتيد ذات نهايات وظيفية مختلفة بناءً على نوع USER المستخدم؛ حيث تتم إزالة ديوكسي يوراسيل. أما نواتج إنزيم نوكلياز Q المستقر حراريًا فهي شقوق تحتوي على مجموعة هيدروكسيل 3′ ومجموعة فوسفات 5′؛ ويبقى ديوكسي يوراسيل موجودًا على الجزء 3′ من الحمض النووي. س: هل يترك أي من إنزيمات USER نهايات قابلة للربط عند القطع عند اليوراسيل؟ ج: لا، لن يترك أي من إنزيم USER (NEB #M5505)، أو إنزيم USER II غير المستقر حراريًا (NEB #M5508)، أو إنزيم USER III المستقر حراريًا (NEB #M5509) نهايات قابلة للربط عند القطع عند اليوراسيل. مع ذلك، يقوم إنزيم Endonuclease Q المستقر حراريًا (NEB #M0701) بقطع الطرف 5' لليوراسيل (مع الحفاظ على القاعدة النيتروجينية سليمة)، ولكنه يترك نهايات قابلة للربط عند 3' OH و5' P بعد القطع. س: ما مدى قرب إنزيم USER (NEB #M5505) من نهايات الحمض النووي DNA التي يمكنه قطعها؟ ج: يقوم إنزيم USER® بقطع ديوكسي يوراسيل في مسافة لا تقل عن 3 أزواج قاعدية من الطرف 5' للحمض النووي DNA ثنائي السلسلة، أو على الأقل 9 نيوكليوتيدات من الطرف 5' للحمض النووي DNA أحادي السلسلة. ستة أزواج قاعدية أو نيوكليوتيدات من الطرف 3' للحمض النووي المزدوج أو المفرد. لمزيد من المعلومات، يُرجى الرجوع إلى قسم "انقسام ديوكسي يوراسيل بالقرب من نهايات الحمض النووي المزدوج والمفرد".