نيو إنجلاند بيولابس، M5509S، إنزيم USER® III المقاوم للحرارة

إنزيم USER III المقاوم للحرارة (كاشف استئصال اليوراسيل النوعي) يُحدث فجوة نيوكليوتيدية واحدة في موقع بقايا اليوراسيل. وهو نشط بين 50 و75 درجة مئوية (يُلاحظ النشاط الأمثل عند 65 درجة مئوية). الفئات ذات الصلة: إنزيمات إصلاح الحمض النووي وإنزيمات النوكلياز الداخلية النوعية للبنية. التطبيقات: تجميع الحمض النووي واستنساخه، حلول الاستنساخ والأتمتة عالية الإنتاجية. المواصفات: تعريف الوحدة : تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لقطع 10 بيكومول من جزيء أوليغونوكليوتيد مزدوج مكون من 60 قاعدة، مُوسَم بصبغة فلورية، يحتوي على قاعدة يوراسيل واحدة، في غضون 15 دقيقة عند 65 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر في محلول Thermopol Buffer بتركيز 1X. شروط التفاعل: محلول تفاعل ThermoPol® بتركيز 1X، يُحضن عند 65 درجة مئوية. محلول تفاعل ThermoPol® بتركيز 1X: 20 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار (NH4)2SO4، 10 ملي مولار KCl، 2 ملي مولار MgSO4، 0.1% Triton® X-100 (الأس الهيدروجيني 8.8 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 15 ملي مولار Tris-HCl، 35 ملي مولار NaCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار، 100 ميكروغرام/مل BSA، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. الأسئلة الشائعة : س: ما هو نشاط إنزيم USER® III المقاوم للحرارة في المحاليل الأخرى؟ ج: إنزيم USER III المقاوم للحرارة نشط بنسبة 100% في محلول ThermoPol®، وله نشاط محدود في المحاليل الأخرى. النشاط في NEBuffers عند 65 درجة مئوية كما يلي: NEBuffer r1.1 r2.1 r3.1 rCutSmart™ % النشاط 100 50 50 75 بالإضافة إلى ذلك، فإن إنزيم USER II الحراري نشط بنسبة 100٪ في العديد من البوليميراز و PCR buffers (انظر الرسم البياني أدناه). نشاط المحلول المنظم (مقارنة بمحلول Thermopol المنظم) محلول تفاعل Thermopol II (NEB #B9004) 100% محلول تفاعل Q5® (NEB #B9027) 50% محلول GoTaq® Flexi عديم اللون (Promega®) 75% محلول PCR (Qiagen®) 75% محلول iTaq 100% محلول AmpliTaq Gold® 360 (ThermoFisher®) 100% محلول Fast Start™ Taq DNA Pol PCR (Sigma Aldrich) 0% محلول Ex Taq (Takara) 0% محلول Dream Taq (ThermoFisher®) 75% محلول Platinum II PCR (Invitrogen) 75% AmpliTaq Gold® و Thermo Fisher® علامتان تجاريتان مسجلتان ومملوكتان لشركة Thermo Fisher Scientific. GoTaq® وPromega® علامتان تجاريتان مسجلتان لشركة Promega, Inc. وQiagen® علامة تجارية مسجلة لشركة Qiagen, Inc. وFast Start™ علامة تجارية لشركة Sigma Aldrich. س: ما هي درجة الحرارة التي يكون عندها إنزيم USER® III المقاوم للحرارة فعالاً؟ ج: يكون إنزيم USER III المقاوم للحرارة فعالاً عند درجات حرارة أعلى من 50 درجة مئوية، مع ذروة فعاليته عند 65 درجة مئوية. ويُلاحظ أدنى مستوى من الفعالية عند درجات حرارة أقل من 50 درجة مئوية. ومثل إنزيم USER (NEB #M5505)، لا يمكن تعطيل إنزيم USER III المقاوم للحرارة بالحرارة، ويجب إزالته بطرق أخرى (مثل التنقية العمودية/استخلاص الفينول والكلوروفورم). س: ما الفرق بين إنزيم USER® III المقاوم للحرارة وإنزيم USER وإنزيم USER II غير المقاوم للحرارة؟ أ: إنزيم USER III المقاوم للحرارة مشابه لإنزيم USER (كاشف استئصال اليوراسيل المحدد) (NEB #M5505) وإنزيم USER II غير المقاوم للحرارة (NEB #M5508)، حيث تُحدث جميعها فجوة نيوكليوتيدية واحدة في موقع اليوراسيل. يتميز إنزيم USER II غير المقاوم للحرارة بميزة إضافية وهي إمكانية تعطيله بالحرارة (65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق)، بينما يبقى إنزيم USER III المقاوم للحرارة فعالاً عند درجات حرارة أعلى (>50 درجة مئوية). يمكن تعطيل إنزيم USER II غير المقاوم للحرارة بالحرارة، بينما يجب إزالة إنزيم USER وإنزيم USER III المقاوم للحرارة من التفاعل بوسائل أخرى (مثل تنظيف العمود أو طرق تنقية أخرى). تقوم جميع إنزيمات USER بكسر العمود الفقري للفوسفودايستر، لكنها تترك نهايات 3′ و5′ مختلفة: يترك نشاط اللياس لإنزيم Endonuclease VIII في إنزيم USER مجموعة فوسفات 3′ ومجموعة فوسفات 5′، ويترك نشاط اللياس لإنزيم Endonuclease III في إنزيم USER II غير المستقر حراريًا مجموعة فوسفات 3′-فوسفات-α، β-ألدهيد غير مشبع ومجموعة فوسفات 5′، ويترك نشاط اللياس لإنزيم Endonuclease IV في إنزيم USER III المستقر حراريًا مجموعة هيدروكسيل 3′ ومجموعة فوسفات ديوكسي ريبوز 5′. يُنتج كل من إنزيم USER (NEB #M5505)، وإنزيم USER II غير المستقر حراريًا (NEB #M5508)، وإنزيم USER III المستقر حراريًا (NEB #M5509) نهايات وظيفية مختلفة بعد قطع الحمض النووي. بالإضافة إلى اختلاف درجات حرارة التفاعل المثلى (37 درجة مئوية لإنزيم USER وإنزيم USER II غير المستقر حراريًا، و65 درجة مئوية لإنزيم USER III المستقر حراريًا) وإمكانية تعطيله بالحرارة (إنزيم USER II غير المستقر حراريًا فقط)، تُنتج إنزيمات USER المختلفة نهايات 3' و5' مختلفة بعد الانقسام. يحتوي إنزيم USER (NEB #M5505) على إنزيم Endonuclease VIII ويترك فوسفاتًا في النهايتين 3' و5' بعد الانقسام. يحتوي إنزيم USER II غير المستقر حراريًا (NEB #M5508) على إنزيم Endonuclease III ويترك فوسفاتًا في النهاية 3' من نوع فوسفات ألفا، بيتا غير المشبع، وفوسفاتًا في النهاية 5' بعد الانقسام. يحتوي إنزيم USER III المستقر حراريًا (NEB #M5509) على إنزيم Endonuclease IV ويترك فوسفاتًا في النهاية 3' من نوع هيدروكسيل وفوسفاتًا في النهاية 5' من نوع ديوكسي ريبوز. س: هل يزيل إنزيم USER® III المقاوم للحرارة اليوراسيل من الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA) وثنائي السلسلة (dsDNA)؟ ج: يزيل إنزيم USER III المقاوم للحرارة اليوراسيل من الحمض النووي أحادي السلسلة بنفس كفاءة إزالته من الحمض النووي ثنائي السلسلة. ولا يؤثر هذا الإنزيم على النيوكليوتيدات (dUTP) في المحلول. س: ما الفرق بين مجموعة إنزيمات USER® (#M5505، #M5508، #M5509) وإنزيم Endonuclease Q المقاوم للحرارة (#M0701)؟ ج: منتجات USER (إنزيم USER (#M5505)، وإنزيم USER II غير المستقر حراريًا (#M5508)، وإنزيم USER III المستقر حراريًا (#M5509)) عبارة عن مزيج من إنزيمين: UDG وإنزيم نوكلياز داخلي. في المقابل، إنزيم نوكلياز Q المستقر حراريًا (#M0701) هو إنزيم واحد. على الرغم من أن إنزيمات USER وإنزيم نوكلياز Q المستقر حراريًا يتعرفان على ديوكسي يوراسيل في ركائز الحمض النووي ويقطعانه، إلا أن النواتج الناتجة مختلفة. النواتج النهائية لإنزيمات USER هي فجوات أحادية النوكليوتيد ذات نهايات وظيفية مختلفة بناءً على نوع USER المستخدم؛ حيث تتم إزالة ديوكسي يوراسيل. أما نواتج إنزيم نوكلياز Q المستقر حراريًا فهي شقوق تحتوي على مجموعة هيدروكسيل 3′ ومجموعة فوسفات 5′؛ ويبقى ديوكسي يوراسيل موجودًا على الجزء 3′ من الحمض النووي. س: هل يترك أي من إنزيمات USER نهايات قابلة للربط عند القطع عند اليوراسيل؟ ج: لا، لن يترك أي من إنزيمات USER (NEB #M5505) أو USER II الحساس للحرارة (NEB #M5508) أو USER III المقاوم للحرارة (NEB #M5509) نهايات قابلة للربط عند القطع عند اليوراسيل. مع ذلك، يقوم إنزيم Endonuclease Q المقاوم للحرارة (NEB #M0701) بقطع الطرف 5' لليوراسيل (مع الحفاظ على سلامة القاعدة النيتروجينية)، ولكنه يترك نهايات قابلة للربط عند 3' OH و5' P بعد القطع. س: ما مدى قرب القطع من نهايات الحمض النووي DNA الذي يمكن أن يقوم به إنزيم USER III المقاوم للحرارة (NEB #M5509)؟ ج: يقوم إنزيم USER® III المقاوم للحرارة بقطع ديوكسي يوراسيل في مسافة لا تقل عن 3 أزواج قاعدية من الطرف 5' للحمض النووي DNA ثنائي السلسلة، أو 12 نيوكليوتيدًا على الأقل من الطرف 5' للحمض النووي DNA أحادي السلسلة. يقوم الإنزيم الثالث بفصل ديوكسي يوراسيل على بعد ثلاثة أزواج قاعدية أو نيوكليوتيدات من الطرف 3' للحمض النووي المزدوج أو المفرد. لمزيد من المعلومات، يُرجى مراجعة قسم "فصل ديوكسي يوراسيل بالقرب من نهايات الحمض النووي المزدوج والمفرد".