نيو إنجلاند بيولابس، M6630S، مزيج إصلاح الحمض النووي NEBNext® FFPE

للحصول على أداء فائق، وحدة إصلاح الحمض النووي FFPE v2 من NEBNext ( الفئات ذات الصلة: الحمض النووي FFPE، مواصفات تحضير مكتبة التسلسل من الجيل التالي ، المواد المطلوبة ولكن غير المرفقة: كواشف بناء المكتبة (مثل: مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي NEBNext Ultra II لجهاز Illumina (NEB #E7645))، إيثانول 100%، ماء خالٍ من النيوكلياز، محلول Tris-HCl بتركيز 10 ملي مولار، درجة الحموضة 8.0 أو 0.1X، أنابيب TE DNA LoBind (Eppendorf #022431021)، خرز AMPure® XP (Beckman Coulter, Inc. #A63881)، قليل النوكليوتيدات المتعددة NEBNext لجهاز Illumina، حامل أو صفيحة مغناطيسية (مثل: حامل الفصل المغناطيسي NEBNext® (NEB #S1515S)، صفيحة Alpaqua® 96S المغناطيسية الفائقة (#A001322)، أو ما يعادلها)، جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، الأسئلة الشائعة: س: هل سيختلط خليط إصلاح الحمض النووي FFPE س: هل سيربط مزيج إصلاح الحمض النووي FFPE شظايا الحمض النووي الخاصة بي؟ ج: إن إنزيم الربط الموجود في مزيج إصلاح الحمض النووي FFPE هو إنزيم ربط الحمض النووي Taq (NEB #M0208). يعمل هذا الإنزيم على سد الشقوق في الحمض النووي بكفاءة، ولكنه غير فعال في ربط الشظايا عند عدم التطابق أو في ربط الحمض النووي ذي النهايات غير المتداخلة. في الواقع، لم نلاحظ أبدًا أن هذا الإنزيم يربط الحمض النووي ذي النهايات غير المتداخلة. س: هل ستؤثر معالجة الحمض النووي الخاص بي بمزيج إصلاح الحمض النووي FFPE سلبًا على التفاعل اللاحق؟ ج: لا. لم نلاحظ أن مزيج إصلاح الحمض النووي FFPE له تأثير سلبي على معظم التطبيقات اللاحقة. سيعمل مزيج الإصلاح فقط على القواعد التالفة والشقوق والفجوات. ومع ذلك، في التطبيقات المتخصصة، مثل الكشف عن المثيلة في العينات التالفة، هناك احتمال أن تؤدي رقعة القواعد التي تم ملؤها أثناء وظيفة ترجمة الشقوق في الإصلاح إلى محو بصمات المثيلة. يكون هذا التأثير أكثر وضوحًا في التجارب التي تحتوي على كميات قليلة من الحمض النووي. س: هل سيؤدي مزيج إصلاح الحمض النووي FFPE إلى جعل نهايات الحمض النووي غير متداخلة؟ ج: لا. إنزيم البوليميراز الموجود في مزيج إصلاح الحمض النووي FFPE، وهو بوليميراز Bst DNA، يملأ النتوءات 5'، لكنه لا يزيل النتوءات 3'. علاوة على ذلك، يضيف هذا البوليميراز قاعدة dA إلى النتوء 5' المملوء. س: هل يُدخل مزيج إصلاح الحمض النووي FFPE نيوكليوتيدات عشوائية في التسلسل الذي يُصلحه؟ ج: لا، يُضيف البوليميراز الموجود في المزيج القواعد المُكملة التي تُطابق قاعدة القالب. لن يُدخل مزيج الإصلاح أي شوائب في التسلسل. س: هل يُزيل مزيج إصلاح الحمض النووي FFPE التعديلات التساهمية من قواعد الحمض النووي، مثل المثيلة أو البيوتين أو الديجوكسيجينين؟ ج: لا، لن يُزيل مزيج الإصلاح هذا التعديلات التساهمية في قواعد الحمض النووي تحديدًا، ولكن قد يتم استبدال القواعد المجاورة لمواقع التلف بقواعد غير مُعدلة أثناء عملية الإصلاح. س: هل يُصلح مزيج إصلاح الحمض النووي FFPE الروابط المتشابكة بين الحمض النووي والبروتين؟ ج: لا، لا يُصلح مزيج الإصلاح الروابط المتشابكة بين الحمض النووي والبروتين. س: هل هل يُصلح مزيج إصلاح الحمض النووي المُستخلص من الأنسجة المُثبتة بالفورمالين والمُضمنة في البارافين (FFPE) النهايات 3' المسدودة؟ ج: نعم، سيُعيد مزيج الإصلاح تكوين النهاية 3' إلى مجموعة هيدروكسيل إذا كانت مسدودة. س: هل يُمكن لمزيج إصلاح الحمض النووي المُستخلص من الأنسجة المُثبتة بالفورمالين والمُضمنة في البارافين (FFPE) إصلاح التلف في كلٍ من الحمض النووي أحادي السلسلة وثنائي السلسلة؟ أم أنه يتطلب حمضًا نوويًا ثنائي السلسلة كقالب؟ ج: مزيج إصلاح الحمض النووي المُستخلص من الأنسجة المُثبتة بالفورمالين والمُضمنة في البارافين (FFPE) مُخصص للاستخدام مع الحمض النووي ثنائي السلسلة. بعض إنزيمات إصلاح الحمض النووي الموجودة في المزيج قادرة على التعرف على التلف في الحمض النووي أحادي السلسلة، لكن خطوات البلمرة والربط تتطلب حمضًا نوويًا ثنائي السلسلة. س: إذا كان لدي قالب حمض نووي يحتوي على مواقع طفرات (مثل 8-أوكسي غوانين أو سيتوزينات منزوعة الأمين) متجاورة مباشرةً على سلسلتين متقابلتين، فهل سيؤدي العلاج بمزيج إصلاح الحمض النووي المُستخلص من الأنسجة المُثبتة بالفورمالين والمُضمنة في البارافين (FFPE) إلى حدوث قطع/كسر في السلسلتين؟ ج: لم نُجرِ اختبارًا لإصلاح مواقع الطفرات المتجاورة على السلسلتين المتقابلتين. في هذه الحالة، إذا تمت إزالة القاعدتين التالفتين في نفس الوقت، فقد يحدث كسر في السلسلتين مما يؤدي إلى تفتت الحمض النووي. أما إذا كان أحد التفاعلين أسرع من الآخر، ولم يحدثا في الوقت نفسه، فإن مزيج إصلاح الحمض النووي FFPE سيقوم بإصلاحهما. س: ما هي أطوال الفجوات التي يمكن إصلاحها باستخدام مزيج إصلاح الحمض النووي FFPE؟ ج: طول الفجوة غير معروف بدقة. بناءً على خبرتنا، يتراوح بين 5 و10 نيوكليوتيدات. س: عند العمل مع الحمض النووي المجزأ، هل سيتم ربط الأطراف معًا بواسطة مزيج تفاعل إصلاح الحمض النووي FFPE؟ ج: لا، إنزيم Taq DNA ligase الموجود في المزيج سيربط فقط عند وجود قطع في الحمض النووي المزدوج. س: كيف يتم إصلاح المواقع الخالية من القواعد بواسطة مزيج تفاعل إصلاح الحمض النووي FFPE؟ ج: بالنسبة للحمض النووي المزدوج، يتعرف مزيج الإصلاح على الموقع الخالي من القواعد ويقطع هيكل الحمض النووي. يستبدل البوليميراز القاعدة المفقودة بالقاعدة الصحيحة، ويقوم الليغاز بربط الحمض النووي. س: هل يمكنني استخدام مزيج إصلاح الحمض النووي FFPE لإصلاح أنواع أخرى من الحمض النووي منخفض الجودة غير الحمض النووي FFPE؟ ج: نعم. سيُصلح هذا المزيج العديد من أنواع تلف الحمض النووي الأساسية الشائعة في أنواع أخرى من الحمض النووي منخفضة الجودة، مثل الحمض النووي المتضرر بالأشعة فوق البنفسجية. س: ما الفرق بين وحدة إصلاح الحمض النووي NEBNext FFPE الإصدار الثاني (NEB #E7360) ومزيج إصلاح الحمض النووي NEBNext FFPE (NEB #M6630)؟ ج: تحتوي وحدة إصلاح الحمض النووي NEBNext FFPE الإصدار الثاني على نفس وظائف الإصلاح الموجودة في مزيج إصلاح الحمض النووي NEBNext FFPE، ولكنها مُحسَّنة لزيادة كفاءة الإصلاح، وتبسيط سير العمل مع تحضير مكتبة NEBNext، وتوفير محلول تفاعل أكثر ملاءمة يحتوي على جميع مكونات المحلول المطلوبة ليس فقط لإصلاح الحمض النووي بكفاءة، بل أيضًا لإصلاح النهايات اللاحقة وإضافة ذيل dA.