نيو إنجلاند بيولابس، M7634S، NEBNext UltraShear®

يُوفر التفتيت الأنزيمي للحمض النووي كجزء من عملية تحضير المكتبة العديد من المزايا مقارنةً بالتفتيت الميكانيكي. مع ذلك، يتطلب التفتيت الأنزيمي استخدام كواشف تفتيت متخصصة للحفاظ على علامات المثيلة على العينات لتحليل الميثيلوم أو لاستخدامها مع عينات صعبة مثل الحمض النووي المُثبت بالفورمالين والمُضمن في البارافين. الفئات ذات الصلة: تجزئة الحمض النووي DNA وتجزئة الحمض النووي RNA، الحمض النووي FFPE، مواصفات تحضير مكتبة التسلسل من الجيل التالي . المواد المطلوبة (غير متوفرة): محلول TE بتركيز 1X (10 ملي مولار Tris pH 8.0، 1 ملي مولار EDTA)، أنابيب PCR رقيقة الجدران سعة 0.2 مل، حامل مغناطيسي (NEB #S1515S؛ Alpaqua® #A001322 أو ما يعادله)، جهاز PCR، جهاز طرد مركزي دقيق Vortex، جهاز Bioanalyzer® أو TapeStation® أو أي محلل شظايا آخر والمواد الاستهلاكية المرتبطة به، إيثانول 80%. للاستخدام مع بروتوكول NEBNext UltraShear: يوصى باستخدام مجموعة كواشف SPRIselect™ (Beckman Coulter, Inc. #B23317)، أو خرز AMPure® XP (Beckman Coulter, Inc. #A63881)، أو مجموعة Monarch®® PCR & DNA Cleanup Kit (NEB# T1030S/L) للقسم 1. مع بروتوكول وحدة إصلاح النهايات/إضافة ذيل dA من NEBNext Ultra II: وحدة إصلاح النهايات/إضافة ذيل dA من NEBNext Ultra II (NEB #E7546S/L) للقسم 2. المواد الموصى بها غير مشمولة: وحدة الربط NEBNext Ultra II (NEB #E7595) و NEBNext Multiplex Oligos (www.neb.com/oligos). للاستخدام مع بروتوكول NEBNext Enzymatic Methyl-seq: مجموعة NEBNext Enzymatic Methyl-seq (NEB #E7120S/L) للقسم 3. فورماميد (Sigma #F9037-100 مل) أو هيدروكسيد الصوديوم 0.1 N اختياري. يُفضل استخدام الفورماميد. في حال استخدام هيدروكسيد الصوديوم (NaOH)، يُرجى مراجعة الأسئلة الشائعة حول مجموعة NEBNext Enzymatic Methyl-seq (NEB #E7120). الأسئلة الشائعة حول المنتجات الخالية من النيوكلياز: س: هل NEBNext UltraShear™ هو نفسه NEBNext® Ultra™ II FS أو NEBNext dsDNA Fragmentase®؟ ج: لا. لا تحتوي هذه الكواشف الإنزيمية لتفتيت الحمض النووي على نفس الإنزيمات. صُمم NEBNext UltraShear خصيصًا للعينات الصعبة، بما في ذلك الحمض النووي المُثبت بالفورمالين والمُضمن في البارافين (FFPE)، ولتحليل الميثيلوم. نوصي باستخدام NEBNext Ultra II FS لتحضير مكتبات الحمض النووي القياسية لتسلسل Illumina®، ويتميز بسير عمل أكثر سلاسة. أما NEBNext dsDNA Fragmentase فهو منتجنا القديم لتفتيت الحمض النووي باستخدام الإنزيمات. س: هل من الضروري حقًا استخدام جهاز الخلط الدوامي مع NEBNext UltraShear™؟ ج: نعم، قد يؤدي عدم استخدام جهاز الخلط الدوامي مع NEBNext UltraShear إلى نتائج غير متناسقة. س: بالنسبة لسير عمل EM-seq™، ما هي التوصيات لتجزئة الحمض النووي المجزأ مسبقًا، أو الحمض النووي ذي السلامة المنخفضة، أو الحمض النووي المُثبَّت في البارافين والمُضمَّن في البارافين (FFPE) باستخدام جهاز NEBNext UltraShear™؟ ج: عند العمل مع الحمض النووي المجزأ مسبقًا، أو ذي السلامة المنخفضة، أو المُثبَّت في البارافين والمُضمَّن في البارافين (FFPE) قبل تحضير مكتبة EM-seq (القسم 5 من دليل NEBNext UltraShear)، نقترح في الخطوة 5.1.6 تجزئة الحمض النووي باستخدام NEBNext UltraShear لفترة أقصر (5-15 دقيقة عند 37 درجة مئوية؛ قد يلزم إجراء بعض التحسينات). بالإضافة إلى ذلك، نقترح إجراء تنظيف باستخدام خرز تنقية العينة بتركيز 0.9X بعد إزالة الأمين من السيتوزين (الخطوة 5.9.2) وبعد تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) (الخطوة 5.11.3). يُرجى ملاحظة أننا لا نوصي بتنظيف دقيق باستخدام خرز تنقية العينة (مثل 0.65X) لعينات الحمض النووي المجزأ مسبقًا، أو ذي السلامة المنخفضة، أو المُثبَّت في البارافين والمُضمَّن في البارافين (FFPE). س: بعد خطوة التجزئة في بروتوكول NEBNext UltraShear™، هل يمكن تخزين التفاعلات عند درجة حرارة -20 درجة مئوية؟ ج: نعم، يمكن تخزين التفاعلات بعد تجزئة NEBNext UltraShear طوال الليل عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. س: هل توصون باستخدام NEBNext UltraShear™ لتحضير مكتبات الحمض النووي DNA بحساسية عالية ومعدل خطأ منخفض؟ ج: تشير التقارير إلى أن استخدام NEBNext UltraShear للتجزئة يؤدي إلى حساسية عالية ومعدل خطأ منخفض مقارنةً بطرق التجزئة الأنزيمية الأخرى والقص الميكانيكي (مثل Covaris®)، قبل تحضير مكتبة الحمض النووي DNA. ومع ذلك، لا تتوفر لدينا بيانات داخلية لهذا التطبيق. س: هل يمكنني تجزئة عينة الحمض النووي الجينومي (gDNA) باستخدام NEBNext UltraShear® في محاليل منظمة أخرى غير محلول TE بتركيز 1X (10 ملي مولار Tris pH 8.0، 1 ملي مولار EDTA)؟ ج: يمكن تجزئة عينات الحمض النووي الجينومي (gDNA) باستخدام جهاز NEBNext UltraShear® مع محاليل الإذابة الشائعة في مجموعات استخلاص الحمض النووي الجينومي، مثل محلول الإذابة Monarch® DNA Elution Buffer، ومحلول الإذابة Monarch® gDNA Elution Buffer، ومحلول الإذابة Monarch® gDNA Elution Buffer II، ومحلول الإذابة EB، ومحلول الإذابة AE، بدلاً من محلول TE 1X ذي الرقم الهيدروجيني 8.0. مع ذلك، تكون عملية التجزئة أبطأ باستخدام جهاز NEBNext UltraShear مع عينات الحمض النووي الجينومي المُجزأة في محاليل الإذابة هذه. لذا، يلزم تحسين ظروف التجزئة، وقد يتطلب الأمر حضانة العينات لفترات أطول عند درجة حرارة 37 أو 45 درجة مئوية مقارنةً بعينات الحمض النووي الجينومي المُجزأة في محلول TE 1X ذي الرقم الهيدروجيني 8.0. محلول استخلاص الحمض النووي Monarch® (NEB #T1016): 10 ملي مولار تريس، 0.1 ملي مولار إيدتا، درجة الحموضة 8.5. محلول استخلاص الحمض النووي الجينومي Monarch® (NEB #T3016): 10 ملي مولار تريس، 0.1 ملي مولار إيدتا، درجة الحموضة 9.0. محلول استخلاص الحمض النووي الجينومي Monarch® II (NEB #T3056) أو المحلول AE: 10 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 0.5 ملي مولار إيدتا، درجة الحموضة 9.0. محلول Qiagen EB: 10 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، درجة الحموضة 8.5. س: إذا استغرقت عملية التجزئة عند 37 درجة مئوية وقتًا طويلاً (30 دقيقة أو أكثر)، فهل هناك طريقة لتسريع عملية التجزئة باستخدام جهاز NEBNext UltraShear؟ ج: إذا لم تحصل على نمط التجزئة المطلوب بعد حضانة مطولة عند 37 درجة مئوية، لتسريع عملية التجزئة، يمكنك حضانة تفاعل NEBNext UltraShear عند 45 درجة مئوية بدلاً من 37 درجة مئوية. لا ننصح ببدء عملية التحسين عند 45 درجة مئوية، لأن معظم العينات تتجزئة عند 37 درجة مئوية. قد يؤدي استخدام درجة حرارة أعلى مباشرةً إلى تجزئة الحمض النووي بشكل مفرط. نوصي باختبار هذه الظروف وتحسينها وفقًا لنوع العينة والتطبيق المحددين لديك.