نيو إنجلاند بيولابس، M7635L، ديوكسي ريبونيوكلياز مزدوج

الفئات ذات الصلة: الإكسونوكليازات والإندونوكليازات غير المحددة. التطبيقات: تخليق الحمض النووي التكميلي. المواصفات: تعريف الوحدة : تُعرف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لإطلاق 3 بيكومول من FAM من أوليغونوكليوتيد دبوس الشعر الموسوم بـ FAM-BHQ1 والمكون من 35 قاعدة في دقيقة واحدة عند 30 درجة مئوية في حجم تفاعل 50 ميكرولتر. شروط التفاعل : محلول NEBuffer™ r2.1 بتركيز 1X، 50 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 10 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). تركيز الاستخدام: 2000 وحدة/مل. محلول التخزين: 10 ملي مولار Tris-HCl، 50 ملي مولار كلوريد البوتاسيوم، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري: 75 درجة مئوية لمدة 10 دقائق بوجود 1 ملي مولار DTT. إذا كانت العينة تحتوي على RNA، يُوصى بإضافة EDTA (بتركيز نهائي 10 ملي مولار) وDTT (بتركيز نهائي 1 ملي مولار) قبل التثبيط الحراري. قد يتحلل RNA عند درجات حرارة أعلى من 65 درجة مئوية بوجود معادن ثنائية التكافؤ مثل Mg2+. الأسئلة الشائعة : س: هل يمكن تعطيل إنزيم دوبلكس ديوكسي ريبونيوكلياز بالحرارة؟ ج: يمكن تعطيل إنزيم دوبلكس ديوكسي ريبونيوكلياز بالحرارة عن طريق إضافة ثنائي ثيوثريتول (DTT) أو أي عامل اختزال آخر (بتركيز نهائي 1 ملي مولار) إلى تفاعل دوبلكس ديوكسي ريبونيوكلياز، ثم حضنه عند 75 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. إذا كانت العينة تحتوي على حمض نووي ريبوزي (RNA)، فنوصي بإضافة ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الأسيتيك (EDTA) (بتركيز نهائي 10 ملي مولار) مع ثنائي ثيوثريتول (DTT) (بتركيز نهائي 1 ملي مولار) قبل التعطيل الحراري، حيث أن درجات الحرارة التي تزيد عن 65 درجة مئوية في وجود معادن ثنائية التكافؤ مثل المغنيسيوم (Mg2+) قد تؤدي إلى تحلل الحمض النووي الريبوزي (RNA). س: هل يُثبط الملح إنزيم دوبلكس ديوكسي ريبونيوكلياز؟ ج: يُثبط الملح إنزيم دوبلكس ديوكسي ريبونيوكلياز بزيادة كمية الملح. نوصي بالحفاظ على تركيز الملح أقل من 50 ملي مولار (تركيز نهائي) في تفاعل دوبلكس ديوكسي ريبونيوكلياز. يُثبط نشاط إنزيم ديوكسي ريبونيوكلياز المزدوج بزيادة تركيز الملح. تم قياس نشاط هذا الإنزيم بمراقبة الزيادة في الفلورة عند قطع ركيزة ديوكسي ريبونيوكلياز مزدوج حلقي الشكل بطول 35 نيوكليوتيد في محلول تفاعل 1X (10 ملي مولار Tris-HCl، درجة الحموضة 7.6، 2.5 ملي مولار MgCl2، 0.5 ملي مولار CaCl2) مع زيادة تركيز الملح، كما هو موضح. س: ما هي درجة الحرارة المثلى لاستخدام إنزيم ديوكسي ريبونيوكلياز المزدوج؟ ج: يعمل هذا الإنزيم ضمن نطاق واسع من درجات الحرارة (25-65 درجة مئوية). تختلف درجة حرارة التفاعل المثلى وقد يلزم تحديدها تجريبياً بناءً على ظروف التفاعل. يقوم إنزيم Duplex DNase بتحليل الحمض النووي المزدوج بشكل تفضيلي في خليط من الحمض النووي المزدوج والحمض النووي المفرد على نطاق واسع من درجات الحرارة. تم تحضين خليط من 20 بيكومول من الحمض النووي المزدوج (أوليغونوكليوتيد 60 زوج قاعدي) و20 بيكومول من الحمض النووي المفرد (أوليغونوكليوتيد 50 نيوكليوتيد) مع وحدتين من إنزيم Duplex DNase لمدة دقيقة واحدة عند 25 درجة مئوية، أو 37 درجة مئوية، أو 50 درجة مئوية، أو 65 درجة مئوية، ثم تم تشغيله على هلام E-gel™ EX بنسبة 4٪ (Thermo Fisher Scientific®) المصبوغ بـ SYBR® Gold. المسار 1: علامة تفاعل البوليميراز المتسلسل للحمض النووي المزدوج (NEB #N3234)، المسار 2: حمض نووي أحادي السلسلة 50 نيوكليوتيد، المسار 3: حمض نووي مزدوج 60 زوج قاعدي، المسارات 4-7: 25 درجة مئوية، 37 درجة مئوية، 50 درجة مئوية، 65 درجة مئوية. يُظهر إنزيم DNase المزدوج نشاطًا متزايدًا وتفضيلًا للحمض النووي المزدوج مع ارتفاع درجة الحرارة. FLUOR = فلوروفور. س: ما هو الحد الأدنى لطول الحمض النووي المزدوج المطلوب لإنزيم DNase المزدوج لقطعه؟ ج: يتطلب إنزيم DNase المزدوج ما لا يقل عن 9-10 أزواج قاعدية من الحمض النووي المزدوج للقطع. س: هل يتطلب إنزيم DNase المزدوج كاتيونات ثنائية التكافؤ؟ ج: نعم، يتطلب إنزيم DNase المزدوج وجود كاتيونات ثنائية التكافؤ، وتحديدًا Mg2+. لا نوصي باستخدام إنزيم DNase المزدوج في وجود الكالسيوم (Ca2+) لأن ذلك سيزيد من نشاط الإنزيم تجاه الحمض النووي أحادي السلسلة. س: ما هي ظروف التفاعل المثلى لإنزيم ديوكسي ريبونوكلياز المزدوج؟ ج: يكون إنزيم ديوكسي ريبونوكلياز المزدوج أكثر نشاطًا في التفاعلات التي تُجرى عند درجة حموضة 7.0، مع وجود أقل من 50 ملي مولار من الملح وأيون ثنائي التكافؤ من المغنيسيوم (Mg2+) (وليس الكالسيوم Ca2+). ويكون هذا الإنزيم نشطًا ضمن نطاق واسع من درجات الحرارة (25-65 درجة مئوية)، ويتطلب ما لا يقل عن 9-10 أزواج قاعدية من الحمض النووي المزدوج لقطعه. س: كيف تُقارن وحدة قياس نشاط إنزيم ديوكسي ريبونوكلياز المزدوج بوحدات قياس نشاط إنزيمات ديوكسي ريبونوكلياز المزدوجة الأخرى؟ ج: على الرغم من أن نشاط إنزيم ديوكسي ريبونوكلياز المزدوج لا يُقاس باستخدام وحدة كونيتز التقليدية، إلا أننا نُقدّر، كما هو الحال مع إنزيمات ديوكسي ريبونوكلياز المزدوجة الأخرى، أن النشاط النوعي لهذا الإنزيم يبلغ 200,000 وحدة/ملغ.