نيو إنجلاند بيولابس، M9204S، بوليميراز الحمض النووي Bst-XT WarmStart™

هل تحتاج إلى مساعدة في تصميم بادئات LAMP؟ استخدم الفئات ذات الصلة: تطبيقات التضخيم متساوي الحرارة وإزاحة السلسلة، التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة، التضخيم متساوي الحرارة، تضخيم الحمض النووي، مواصفات PCR وqPCR. محلول التخزين: 20 ملي مولار Tris-HCl، 100 ملي مولار KCl، 0.5 ملي مولار TCEP، 0.1 ملي مولار EDTA، مثبتات 1X، 50% جلسرين، درجة الحموضة 7.5. الأسئلة الشائعة : س: هل يمكن تعطيل بوليميراز الحمض النووي Bst-XT بالحرارة؟ ج: نعم، سخّنه عند 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي Bst-XT في درجات حرارة أخرى غير 65 درجة مئوية لتفاعلات LAMP؟ ج: نعم، يمكن استخدام Bst-XT لإجراء تفاعلات LAMP عبر نطاق واسع من درجات الحرارة (50 درجة مئوية - 70 درجة مئوية). قد يختلف الأداء الأمثل بين مجموعات البادئات/المضخمات، لذا قد تكون درجات حرارة الفحص مفيدة. لا يُنصح باستخدام Bst-XT في درجات حرارة أعلى من 72 درجة مئوية. س: هل يمكن تخفيف بوليميراز الحمض النووي Bst-XT؟ ج: نعم. يمكن تخفيف Bst-XT قبل الاستخدام مباشرةً. عند تخفيف منتج Bst-XT الخالي من الجلسرين بتركيز 120,000 وحدة/مل باستخدام محلول التضخيم متساوي الحرارة Bst-XT بتركيز 1X (إلى 8,000 وحدة/مل)، يمكن تخزين Bst-XT المخفف في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 7 أيام. س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي Bst-XT في الكشف اللوني النهائي؟ ج: نعم، يمكن استخدام Bst-XT في الكشف اللوني النهائي باستخدام أصباغ مؤشر المعادن غير المعتمدة على الرقم الهيدروجيني، بما في ذلك أزرق هيدروكسي نافثول (HNB). نوصي بإضافة 120 ميكرومول من HNB إلى 25 ميكرولتر من تفاعل LAMP/RT-LAMP. عند استخدام HNB، يمكن زيادة تركيز كبريتات المغنيسيوم النهائي حتى 8 ملي مولار لتحسين تباين اللون بين العينات الموجبة والسالبة. س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي Bst-XT مع محاليل NEB الأخرى؟ ج: يُحقق الأداء الأمثل باستخدام محلول التضخيم متساوي الحرارة Bst-XT المرفق (NEB #B9250) بتركيز 1X و6 ملي مولار من كبريتات المغنيسيوم. مع ذلك، يمكن استخدام Bst-XT بنجاح مع محلول التضخيم متساوي الحرارة (NEB #B0537) و6 ملي مولار من كبريتات المغنيسيوم، على الرغم من احتمال ملاحظة تأخير في وقت الكشف. لا نوصي باستخدام محلول التضخيم متساوي الحرارة II (NEB #B0374) أو محلول ThermoPol® (NEB #B9004) مع بوليميراز الحمض النووي Bst-XT لأن الأداء ينخفض ​​بشكل كبير. س: كيف يمكنني تحسين تفاعلات LAMP/RT-LAMP للأهداف الصعبة عند استخدام Bst-XT؟ ج: بالنسبة للأهداف الصعبة و/أو ذات النسخ المنخفضة، يمكن تعديل ظروف التفاعل التالية: يمكن زيادة وقت التفاعل حتى 40 دقيقة، ويمكن زيادة تركيز الإنزيم حتى 600 وحدة/مل، ويمكن تحسين تركيز كبريتات المغنيسيوم النهائي (عادةً 6-8 ملي مولار). س: كيف أستخدم إنزيم UDG غير المستقر حراريًا في القطب الجنوبي لمنع التلوث المتبقي في تفاعلات LAMP؟ ج: يتطلب منع التلوث المتبقي جزأين: دمج dUTP بواسطة بوليميراز الحمض النووي أثناء تكوين الأمبليكون، واستئصال اليوراسيل من المنتجات المضخمة وتدمير الأمبليكون بواسطة إنزيم UDG. بالنسبة لتفاعلات LAMP، يجب إجراء التفاعلات مع إضافة حوالي 50% من dUTP ممزوجًا بـ dTTP (مثل 1.4 ملي مولار من dATP، وdCTP، وdGTP، و0.7 ملي مولار من dTTP، وdUTP)، ويجب استخدام بوليميراز الحمض النووي Bst لدمج dU بكفاءة دون تثبيط كبير للتفاعل. لتدمير الملوثات لاحقًا، يُنصح بشدة باستخدام إنزيم UDG المقاوم للحرارة في القطب الجنوبي بدلاً من إنزيم UDG الخاص ببكتيريا الإشريكية القولونية الأكثر استقرارًا حراريًا. أضف 0.5 ميكرولتر من إنزيم UDG المقاوم للحرارة في القطب الجنوبي لكل 25 ميكرولتر من تفاعل LAMP، ثم قم بإعداد وتشغيل تفاعلات LAMP كالمعتاد. سيعمل إنزيم UDG أثناء الإعداد والتسخين إلى 65 درجة مئوية على تدمير أي ملوثات بسرعة وكفاءة. في حال الحاجة إلى تطهير أكثر دقة، يمكن إضافة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية في بداية سير العمل. ولتبسيط العملية، تم تضمين dUTP وUDG في مجموعة WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix المُحدثة مع UDG ومجموعة WarmStart Fluorescent LAMP/RT-LAMP (مع UDG). سؤال: ما هو LAMP وRT-LAMP؟ أ: تضخيم الحمض النووي المتساوي الحرارة بوساطة الحلقة (LAMP) هو طريقة تضخيم متساوية الحرارة مصممة للكشف عن الحمض النووي المستهدف دون الحاجة إلى معدات معقدة. تستخدم هذه الطريقة بوليميراز DNA مُزيح للسلسلة، مثل بوليميراز Bst DNA، و4-6 بادئات تتعرف على 6-8 مناطق متميزة من الحمض النووي المستهدف لإجراء تفاعل تضخيم عالي التخصص. توفر LAMP حساسية عالية (تصل إلى فيمتوغرام أو أقل من 10 نسخ من الحمض النووي المستهدف) مع نتائج سريعة: يمكن إجراء التفاعلات في غضون 5-10 دقائق فقط. يمكن إجراء التفاعلات بموارد محدودة، باستخدام حمام مائي للحضانة والكشف عن النتائج بالعين المجردة، أو باستخدام القياس في الوقت الحقيقي وأجهزة عالية الإنتاجية. يتم الكشف عن أهداف الحمض النووي الريبوزي (RNA) ببساطة عن طريق إضافة إنزيم النسخ العكسي إلى تفاعل LAMP، حيث يتم إجراء RT-LAMP كعملية متساوية الحرارة من خطوة واحدة. إنزيم النسخ العكسي WarmStart RTx (NEB #M0380) هو بوليميراز DNA موجه بواسطة RNA، مقترن بأبتامر قابل للارتباط العكسي، مما يثبط نشاط RTx عند درجة حرارة أقل من 40 درجة مئوية، وهو ما يجعله مناسبًا بشكل خاص لتقنية RT-LAMP. لمعرفة المزيد والاطلاع على منتجاتنا الخاصة بتقنية LAMP، يرجى زيارة صفحة نظرة عامة على تطبيقات LAMP. س: ما الفرق بين بوليميراز Bst DNA، الجزء الكبير، وBst 2.0، وBst 3.0، وبوليميراز Bst-XT DNA؟ ج: جميع البوليميرازات الأربعة هي بوليميرازات DNA متوسطة الثبات الحراري، تتميز بنشاط إزاحة السلسلة، مما يُمكّنها من إجراء تفاعلات التضخيم متساوي الحرارة مثل LAMP. يُعد بوليميراز Bst 2.0 DNA نظيرًا مُصممًا حاسوبيًا لبوليميراز Bst DNA، الجزء الكبير. وقد صُمم لتحسين خصائصه في تفاعلات LAMP، بما في ذلك تحمل الملوحة، والثبات الحراري، ودمج dUTP. يتميز إنزيم Bst 2.0 بدقة عالية. ويُقدم إنزيم Bst 3.0 بعض التحسينات على Bst 2.0، أبرزها سرعة تضخيم أعلى. كما يتميز Bst 3.0 بأداء مُحسّن في تفاعلات LAMP عند درجات حرارة أعلى (تصل إلى 72 درجة مئوية)، إلا أنه لا يحتفظ بدقة Bst 2.0 العالية لبعض الأهداف. أما إنزيم Bst-XT فيجمع بين أفضل خصائص Bst 2.0 وBst 3.0، حيث يوفر دقة Bst 2.0 العالية وسرعة تضخيم Bst 3.0 العالية. كما يتميز Bst-XT بنشاطه ضمن نطاق أوسع من درجات الحرارة، مما يُتيح إجراء تفاعلات LAMP بين 50 و70 درجة مئوية. Bst-XT WarmStart NEB #M9204 Bst 2.0 WarmStart NEB #M0538 Bst 3.0 NEB #M0374 سرعة التضخيم ★★★★★ ★★★ ★★★★★ الخصوصية ★★★★★ ★★★★★ ★★ إعداد درجة حرارة الغرفة؟ مُفعّل مُفعّل غير مُوصى به درجة حرارة تفاعل LAMP المثلى 50-70 درجة مئوية 60-70 درجة مئوية 55-72 درجة مئوية متوفر خالي من الجلسرين نعم NEB #M9205 نعم NEB #M0402 نعم NEB #M0443 ★★★★★ = المنتج الأمثل والموصى به للتطبيق المحدد ★★ أو ★★★ = سيؤدي الغرض في التطبيق المحدد ★ = قد يؤدي الغرض ولكن لا يُوصى به س: ما هو التركيز الموصى به لأيونات المغنيسيوم (Mg+2) لاستخدامه مع Bst-XT في تفاعلات LAMP؟ ج: نوصي باستخدام 6 ملي مولار من كبريتات المغنيسيوم (MgSO4) في تفاعلات LAMP وRT-LAMP مع Bst-XT. يحتوي محلول التضخيم متساوي الحرارة Bst-XT على 2 ملي مول من كبريتات المغنيسيوم بتركيز 1X، لذا يُنصح بإضافة 4 ملي مول أخرى من كبريتات المغنيسيوم باستخدام محلول كبريتات المغنيسيوم المرفق بتركيز 100 ملي مول (NEB #B1003). في حال الحاجة إلى مزيد من التحسين، يمكن زيادة تركيز كبريتات المغنيسيوم النهائي إلى 8 ملي مول.