نيو إنجلاند بيولابس، M9205L، بوليميراز الحمض النووي Bst-XT WarmStart™ (خالي من الجلسرين)

هل تحتاج إلى مساعدة في تصميم بادئات LAMP؟ استخدم الفئات ذات الصلة: تطبيقات التضخيم متساوي الحرارة وإزاحة السلسلة، التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة، التضخيم متساوي الحرارة، تضخيم الحمض النووي، PCR وqPCR. المواصفات : محلول التخزين: 20 ملي مولار Tris-HCl، 100 ملي مولار KCl، 0.5 ملي مولار TCEP، 0.1 ملي مولار EDTA، مثبتات 1X، درجة الحموضة 7.5. الأسئلة الشائعة : س: هل يمكن تعطيل بوليميراز الحمض النووي Bst-XT بالحرارة؟ ج: نعم، سخّنه عند 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي Bst-XT في درجات حرارة أخرى غير 65 درجة مئوية لتفاعلات LAMP؟ ج: نعم، يمكن استخدام Bst-XT لإجراء تفاعلات LAMP عبر نطاق واسع من درجات الحرارة (50 درجة مئوية - 70 درجة مئوية). قد يختلف الأداء الأمثل بين مجموعات البادئات/المضخمات، لذا قد تكون درجات حرارة الفحص مفيدة. لا يُنصح باستخدام إنزيم Bst-XT في درجات حرارة أعلى من 72 درجة مئوية. س: هل يمكن استخدام إنزيم Bst-XT DNA بوليميراز في الكشف اللوني النهائي؟ ج: نعم، يمكن استخدام إنزيم Bst-XT في الكشف اللوني النهائي باستخدام أصباغ مؤشرة معدنية غير معتمدة على الرقم الهيدروجيني، بما في ذلك هيدروكسي نافثول الأزرق (HNB). نوصي بإضافة 120 ميكرومول من HNB إلى 25 ميكرولتر من تفاعل LAMP/RT-LAMP. عند استخدام HNB، يمكن زيادة تركيز كبريتات المغنيسيوم (MgSO4) النهائي إلى 8 ملي مول لتعزيز تباين اللون بين العينات الموجبة والسالبة. س: هل يمكن تخفيف إنزيم Bst-XT DNA بوليميراز؟ ج: نعم. يمكن تخفيف إنزيم Bst-XT قبل الاستخدام مباشرة. عند تخفيف منتج Bst-XT الخالي من الجلسرين بتركيز 120,000 وحدة/مل باستخدام محلول التضخيم المتساوي الحرارة Bst-XT بتركيز 1X (إلى 8,000 وحدة/مل)، يمكن تخزين Bst-XT المخفف عند درجة حرارة 4 مئوية لمدة تصل إلى 7 أيام. س: كيف يمكنني تحسين تفاعلات LAMP/RT-LAMP للأهداف الصعبة عند استخدام Bst-XT؟ ج: بالنسبة للأهداف الصعبة و/أو ذات النسخ المنخفضة، يمكن تعديل ظروف التفاعل التالية: يمكن زيادة وقت التفاعل حتى 40 دقيقة، ويمكن زيادة تركيز الإنزيم حتى 600 وحدة/مل، ويمكن تحسين تركيز كبريتات المغنيسيوم النهائي (عادةً 6-8 ملي مولار). س: كيف أستخدم UDG غير المستقر حراريًا في القطب الجنوبي لمنع التلوث المتبقي في تفاعلات LAMP؟ أ: يتطلب منع التلوث العابر جزأين: دمج dUTP بواسطة بوليميراز الحمض النووي أثناء تكوين الأمبليكون، واستئصال اليوراسيل من المنتجات المُضخّمة وتدمير الأمبليكون بواسطة إنزيم UDG. بالنسبة لتقنية LAMP، يجب إجراء التفاعلات مع إضافة حوالي 50% من dUTP ممزوجًا بـ dTTP (مثل 1.4 ملي مولار من dATP، dCTP، dGTP، و0.7 ملي مولار من dTTP وdUTP)، ويُفضل استخدام بوليميراز الحمض النووي Bst لدمج dU بكفاءة دون تثبيط ملحوظ للتفاعل. لتدمير المنتجات الملوثة لاحقًا، يُوصى بشدة باستخدام إنزيم UDG المقاوم للحرارة في القطب الجنوبي بدلًا من إنزيم UDG الأكثر استقرارًا حراريًا في بكتيريا الإشريكية القولونية. أضف 0.5 ميكرولتر من إنزيم UDG المقاوم للحرارة في القطب الجنوبي لكل 25 ميكرولتر من تفاعل LAMP، ثم قم بإعداد وتشغيل تفاعلات LAMP كالمعتاد. يُؤدي نشاط إنزيم UDG أثناء التحضير والتسخين إلى 65 درجة مئوية إلى تدمير أي منتجات ملوثة بسرعة وكفاءة. في حال الحاجة إلى تطهير أكثر صرامة، يُمكن إضافة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية في بداية سير العمل. ولتبسيط العملية، تم تضمين dUTP وUDG في مجموعة WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix المُحدثة مع UDG ومجموعة WarmStart Fluorescent LAMP/RT-LAMP Kit (مع UDG). سؤال: ما عدد دورات التجميد/الإذابة التي يتحملها إنزيم Bst-XT WarmStart® DNA Polymerase (الخالي من الجلسرين)؟ جواب: تم ​​اختبار إنزيم Bst-XT WarmStart DNA Polymerase (الخالي من الجلسرين) لما يصل إلى 30 دورة تجميد/إذابة عند تركيز 120,000 وحدة/مل، ولم يُظهر أي فقدان في النشاط في تفاعل LAMP. مع ذلك، يُنصح بتجنب التجميد والإذابة المتكررين لهذا المنتج. يمكن تخزين الإنزيم (120,000 وحدة/مل) عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر. س: ما هما LAMP وRT-LAMP؟ ج: تضخيم الحمض النووي المتساوي الحرارة بوساطة الحلقة (LAMP) هو طريقة تضخيم متساوية الحرارة مصممة للكشف عن الحمض النووي المستهدف دون الحاجة إلى معدات معقدة. تستخدم هذه الطريقة بوليميراز DNA مُزيح للسلسلة، مثل بوليميراز Bst DNA، و4-6 بادئات تتعرف على 6-8 مناطق مميزة من الحمض النووي المستهدف لإجراء تفاعل تضخيم عالي التخصص. يوفر LAMP حساسية عالية (تصل إلى فيمتوغرام أو أقل من 10 نسخ من الحمض النووي المستهدف) مع نتائج سريعة: يمكن إجراء التفاعلات في غضون 5-10 دقائق فقط. يمكن إجراء التفاعلات بموارد محدودة، باستخدام حمام مائي للحضانة والكشف عن النتائج بالعين المجردة، أو باستخدام القياس في الوقت الحقيقي وأجهزة عالية الإنتاجية. يتم الكشف عن أهداف الحمض النووي الريبوزي (RNA) ببساطة عن طريق إضافة إنزيم النسخ العكسي إلى تفاعل LAMP، حيث يُجرى تفاعل RT-LAMP كعملية متساوية الحرارة في خطوة واحدة. إنزيم النسخ العكسي WarmStart RTx (NEB #M0380) هو بوليميراز DNA موجه للحمض النووي الريبوزي، مُقترن بأبتامر قابل للارتباط العكسي، مما يُثبط نشاط RTx عند درجة حرارة أقل من 40 درجة مئوية، وهو ما يجعله مناسبًا بشكل خاص لتفاعل RT-LAMP. لمعرفة المزيد والاطلاع على منتجاتنا الخاصة بتقنية LAMP، يُرجى زيارة صفحة نظرة عامة على تطبيقات LAMP. س: ما هو التركيز الموصى به لأيونات المغنيسيوم (Mg+2) لاستخدامها مع Bst-XT في تفاعلات LAMP؟ ج: نوصي باستخدام 6 ملي مولار من كبريتات المغنيسيوم (MgSO4) في تفاعلات LAMP وRT-LAMP مع Bst-XT. يحتوي محلول التضخيم متساوي الحرارة Bst-XT على 2 ملي مول من كبريتات المغنيسيوم بتركيز 1X، لذا يُنصح بإضافة 4 ملي مول إضافية من كبريتات المغنيسيوم إلى محلول كبريتات المغنيسيوم المرفق بتركيز 100 ملي مول (NEB #B1003). في حال الحاجة إلى مزيد من التحسين، يمكن زيادة تركيز كبريتات المغنيسيوم النهائي إلى 8 ملي مول. س: ما الفرق بين بوليميراز الحمض النووي Bst، للقطع الكبيرة، وBst 2.0، وBst 3.0، وبوليميراز الحمض النووي Bst-XT؟ ج: جميع البوليميرازات الأربعة هي بوليميرازات حمض نووي متوسطة الثبات الحراري، تتميز بنشاط إزاحة السلسلة، مما يُمكّنها من إجراء تفاعلات التضخيم متساوي الحرارة مثل LAMP. يُعد بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0 نظيرًا مُصممًا حاسوبيًا لبوليميراز الحمض النووي Bst، للقطع الكبيرة. وقد صُمم لتحسين خصائصه في تفاعلات LAMP، بما في ذلك تحمل الملوحة، والثبات الحراري، ودمج dUTP. يتميز إنزيم Bst 2.0 بدقة عالية. ويُقدم إنزيم Bst 3.0 بعض التحسينات على Bst 2.0، أبرزها سرعة تضخيم أعلى. كما يتميز Bst 3.0 بأداء مُحسّن في تفاعلات LAMP عند درجات حرارة أعلى (تصل إلى 72 درجة مئوية)، إلا أنه لا يحتفظ بدقة Bst 2.0 العالية لبعض الأهداف. أما إنزيم Bst-XT فيجمع بين أفضل خصائص Bst 2.0 وBst 3.0، حيث يوفر دقة Bst 2.0 العالية وسرعة تضخيم Bst 3.0 العالية. كما يتميز Bst-XT بنشاطه ضمن نطاق أوسع من درجات الحرارة، مما يُتيح إجراء تفاعلات LAMP بين 50 و70 درجة مئوية. Bst-XT WarmStart NEB #M9204 Bst 2.0 WarmStart NEB #M0538 Bst 3.0 NEB #M0374 سرعة التضخيم ★★★★★ ★★★ ★★★★★ الخصوصية ★★★★★ ★★★★★ ★★ إعداد درجة حرارة الغرفة؟ مُفعّل مُفعّل غير مُوصى به درجة حرارة المصباح المثلى 50-70 درجة مئوية 60-70 درجة مئوية 55-72 درجة مئوية متوفر خالي من الجلسرين نعم NEB #M9205 نعم NEB #M0402 نعم NEB #M0443 ★★★★★ = المنتج الأمثل والموصى به للتطبيق المحدد ★★ أو ★★★ = سيؤدي الغرض في التطبيق المحدد ★ = قد يؤدي الغرض ولكن لا يُوصى به