نيو إنجلاند بيولابس، N0378S، ناقل pMAL-c6T

صُمم ناقل pMAL-c6T لإنتاج بروتينات اندماجية مع بروتين ربط المالتوز (MBP) في السيتوبلازم. وقد تم تعديل بروتين MBP هندسيًا لزيادة ارتباطه براتنج الأميلوز. يعبر الناقل عن بروتين MBP موسوم بالهيستيدين في الطرف الأميني. الفئات ذات الصلة: نظام دمج وتنقية بروتين MBP من NEBExpress، التعبير عن البروتين في بكتيريا الإشريكية القولونية، بلازميدات الحمض النووي والركائز، التطبيقات، عدم ذوبان البروتين المستهدف، التعبير غير T7، التعبير عن البروتينات الصعبة، تحديد علامة التقارب، بروتين ربط المالتوز (MBP) ، ملفات التسلسل، ملف Fasta، GenBank، الأسئلة الشائعة : س: ما هي السلالات التي توصون بها كمضيفات لناقلات pMAL؟ ج: نوصي باستخدام بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة من NEBExpress (NEB #C2523). هذه سلالة من الإشريكية القولونية B مشابهة لسلالتي T7 Express وBL21 (DE3)، باستثناء أنها تفتقر إلى بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 (تستخدم نواقل pMAL بوليميراز الحمض النووي الريبي الخاص بالإشريكية القولونية). تعطي سلالات الإشريكية القولونية المؤهلة NEB Express وT7 Express (NEB #C2566) وBL21 (NEB #C2530) وBL21(DE3) (NEB #C2527) نتائج مماثلة - لا يبدو أن وجود بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 له أي تأثير. تشمل السلالات الناجحة الأخرى سلالتي الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 10-beta (NEB #C3019) وNEB Turbo (NEB #C2984). يمكن البدء بسلالة NEB Express، أو بأي خلايا مؤهلة متوفرة بسهولة، ثم تجربة سلالة أخرى في حال ظهور مشكلة في التعبير أو التنقية. س: ما هي البادئات التي يجب استخدامها لتسلسل نهايات القطعة المُدخلة بعد استنساخها في ناقل pMAL؟ ج: يمكن استخدام بادئات التسلسل التالية (غير متوفرة من شركة نيو إنجلاند بيولابس): بادئة malE على الجانب 5′ من القطعة المُدخلة، وبادئة pMAL العكسية للتسلسل من الجانب 3′. البادئة الأمامية (24 قاعدة، قبل موقع التسلسل الرئيسي) 5′d(GGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCC)3′، والبادئة العكسية (24 قاعدة، بعد موقع التسلسل الرئيسي) 5′d(TGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCAC)3′. تتوفر تسلسلات متجهات pMAL أيضًا على الموقع www.neb.com. يمكن إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للقطع المُدخلة المُستنسخة في موقع التسلسل الرئيسي باستخدام نفس زوج البادئات. س: ما هو الحد الأدنى لحجم القطعة التي يمكن استنساخها في pMAL والتعبير عنها مُدمجة مع بروتين MBP؟ هل يمكن إضافة تسلسلات ببتيدية قصيرة (حوالي 10 أحماض أمينية) إلى بروتين MBP؟ ج: يمكن استخدام نظام MBP للتعبير عن الببتيدات القصيرة. مع ذلك، ينتج عن 40 ملغ من بروتين المايلين القاعدي (MBP) حوالي 1 ملغ من ببتيد مكون من 10 أحماض أمينية (1.1 كيلو دالتون). س: ما هو تسلسل الحمض النووي لهذا المنتج؟ ج: يمكن العثور على تسلسل الحمض النووي في أداة تسلسلات وخرائط الحمض النووي. س: ما هي الاختلافات بين أجيال نواقل pMAL (مثل pMAL-c2 مقابل pMAL-c5 مقابل pMAL-c6 أو pMAL-p2 مقابل pMAL-p5)؟ ج: في جميع النواقل، يشير الرمز "-c" إلى التعبير السيتوبلازمي، أي أنه تم حذف تسلسل الإشارة الذي يوجه بروتين المايلين القاعدي إلى الفراغ المحيط بالبلازما. أما النواقل التي تحمل الرمز "-p" فتشير إلى التعبير المحيط بالبلازما، وتحتوي هذه النواقل على تسلسل إشارة malE من النوع البري. نواقل pMAL من الجيل الأول: تُعد نواقل pMAL-c و-cRI و-p أقدم إصدارات نواقل pMAL. يحتوي كل من pMAL-c وpMAL-p على موقع StuI في منطقة الربط المتعددة لاستنساخ الشظايا ذات النهايات غير المتداخلة. ولأن النصف الثاني من موقع StuI يُشفّر البرولين، فإذا تم استنساخ شظية EcoRI في pMAL-c أو pMAL-p، فإن موقع العامل Xa يقرأ IEGRP، ولن يتمكن RP من القطع بواسطة العامل Xa. صُمم pMAL-cRI كحل مؤقت لهذه المشكلة، وذلك بتغيير منطقة الربط المتعددة لتشفير IEGRI قبل موقع EcoRI. متجهات pMAL-2 من الجيل الثاني: تُعد متجهات pMAL-c2 وpMAL-p2 الجيل التالي من متجهات pMAL. تتجنب هذه المتجهات مشكلة القطع بواسطة العامل Xa باستخدام موقع XmnI بدلاً من StuI. تحتوي هذه النواقل أيضًا على فاصل بين جين malE وموقع العامل Xa، مما يسمح لبعض الاندماجات بالارتباط بقوة أكبر براتنج الأميلوز، بالإضافة إلى منشأ M13 لإنتاج الحمض النووي أحادي السلسلة. نواقل pMAL من الجيل الثالث: يتميز الجيل الثالث من نواقل pMAL بإضافة نواقل تستبدل موقع العامل Xa بموقع إنتيروكيناز أو جينيناز I. تُسمى هذه النواقل pMAL-c2E وpMAL-p2E (إنتيروكيناز)، وpMAL-c2G وpMAL-p2G (جينيناز). أما إصدارات العامل Xa، فتُسمى الآن pMAL-c2X وpMAL-p2X حرصًا على التناسق. يحتوي هذا الجيل الثالث من النواقل على بعض التعديلات الطفيفة خارج منطقة الربط المتعدد أيضًا. فقد تم تعطيل موقع NdeI في منشأ pBR322 عن طريق الاستبدال، وأُضيف موقع NdeI عند كودون البدء ATG لجين malE باستخدام الطفرات الموجهة للموقع. يسمح هذا بفصل جين malE المدمج لإعادة استنساخه، على سبيل المثال في ناقل حقيقي النواة. تم تعطيل موقع NcoI في malE، وكذلك موقع AvaI في منشأ M13، مما يجعل موقع AvaI الموجود في اتجاه 5' لموقع العامل Xa فريدًا. ناقل pMAL-III: هو مشتق خاص من pMAL-p2، مصمم لتسهيل النقل المباشر للتسلسلات المختارة من أي من مكتبات ببتيدات عرض العاثيات Ph.D. إلى ناقل التعبير. على عكس نواقل pMAL الأخرى، التي تضع التسلسل المطلوب في اتجاه 3' من malE، في هذا الناقل يتم دمج التسلسل الذي يشفر الببتيد مع الطرف الأميني لـ malE. نواقل pMAL-4 من الجيل الرابع: تشبه نواقل pMAL-4 نواقل pMAL-2، باستثناء أن MBP قد تم هندسته للارتباط بشكل أقوى بالأميلوز. هيكل الناقل وموقع الاستنساخ المتعدد متطابقان مع نواقل pMAL-2. نواقل pMAL-5 من الجيل الخامس: تشترك نواقل pMAL-5 مع نواقل pMAL-4 في جين malE المُهندس، ولكنها تختلف في موقع الاستنساخ المتعدد وبعض الاختلافات في هيكل الناقل. موقع الاستنساخ المتعدد مطابق لموقع pKLAC2 وpTYB21، مما يُسهّل استنساخ نفس الجزء المُدخل في نواقل متعددة: pKLAC2 للتعبير في بكتيريا K. lactis باستخدام مجموعة K. lactis Expression Kit (#E1000)، أو pTYB21 للتعبير في بكتيريا E. coli باستخدام مجموعة IMPACT kit (#E6901). يلي موقع الاستنساخ المتعدد كودونات توقف في جميع الأطر الثلاثة، ولا يحمل هيكل الناقل جين lacZα أو أصل M13. ناقل pMAL-6 من الجيل السادس: يشترك ناقل pMAL-c6T في جين malE المُهندس مع نواقل سلسلتي pMAL-4 و5، ولكنه يحتوي على وسم سداسي الهيستيدين في الطرف الأميني. يتميز ناقل pMAL-c6T بموقع استنساخ متعدد مختلف، ولكنه لا يزال يحتوي على كودونات توقف في جميع الأطر الثلاثة، ويشترك في مجموعة فرعية من تسلسلات التعرف على إنزيمات التقييد مع تلك الموجودة في ناقل pKLAC2 للتعبير في بكتيريا K. lactis باستخدام مجموعة K. lactis Expression Kit (#E1000) أو ناقل pTYB21 للتعبير في بكتيريا E. coli باستخدام مجموعة IMPACT kit (#E6901). تم استبدال موقع التعرف على بروتياز العامل Xa بموقع التعرف على بروتياز TEV في الرابط المتعدد بين MBP والبروتين المستهدف. لا يحمل هيكل الناقل جين lacZα أو أصل M13. لاحظ أنه لا يوجد ناقل من الجيل السادس لإفراز بروتينات الاندماج MBP إلى الفراغ المحيط بالبلازما.