نيو إنجلاند بيولابس، N0556S، سلم الحمض النووي Quick-Load® الأرجواني 50 زوجًا قاعديًا

الفئات ذات الصلة: سلالم الحمض النووي الأرجوانية سريعة التحميل، علامات وسلالم الحمض النووي، تطبيقات تحليل الحمض النووي، المواصفات: القواعد ، كتلة القطعة (نانوغرام) زوج قاعدي، 1 103 1350، 2 70 916، 3 58 766، 4 54 700، 5 50 650، 6 46 600، 7 42 550، 8 76 500، 9 34 450، 10 31 400، 11 27 350، 12 46 300، 13 57 250، 14 107 200، 15 46 150، 16 69 100، 17 84 50، نطاق الحجم الفعال: من 50 إلى 1350 زوج قاعدي ، محلول التخزين: 2.5% فيكول-400، 10 ملي مولار إيدتا، 3.3 ملي مولار Tris-HCl 0.001% صبغة 2 0.02% صبغة 1 درجة الحموضة 8 عند 25 درجة مئوية. الأسئلة الشائعة : س: لماذا تظهر حزم إضافية على هلامات البولي أكريلاميد؟ ج: لزيادة وضوح الحزم الأصغر وحزم المرجع، تم استنساخ عدة أجزاء من نفس الحجم في البلازميدات المستخدمة في العديد من سلالم الحمض النووي. هذه الأجزاء، المتطابقة في الحجم، لا يمكن تمييزها على هلامات الأغاروز، ولكن على هلامات الأكريلاميد، حتى الاختلافات الطفيفة في تسلسل الحمض النووي يمكن أن تؤدي إلى معدلات هجرة مختلفة بشكل ملحوظ. لا تتحرك الأجزاء من نفس الحجم دائمًا بنفس الطريقة على الأكريلاميد. بالنسبة لسلم الحمض النووي 100 زوج قاعدي، فإن الجزأين 500 و517 زوج قاعدي، اللذين يتحركان كزوج متقارب على الأغاروز، ينفصلان بوضوح شديد على الأكريلاميد، حيث يقع الشريط 517 زوج قاعدي تقريبًا في منتصف المسافة بين الجزأين 500 و600 زوج قاعدي. تُعدّ هذه الهجرة "الشاذة" سمةً متأصلةً في عملية الفصل الكهربائي على هلام الأكريلاميد، ولا تُشير إلى أي خطأ في الحجم المُحدد لقطع الحمض النووي في سلمنا. بالنسبة لسلم الحمض النووي 50 زوجًا قاعديًا وسلم الوزن الجزيئي المنخفض، تميل اثنتان أو أكثر من الحزم المكونة لحزمة المرجع 200 زوجًا قاعديًا إلى الظهور بشكل مختلف، مما ينتج عنه حزمة إضافية أو أكثر قابلة للكشف حول نطاق 200 زوجًا قاعديًا. وكما هو الحال مع سلم الحمض النووي 100 زوجًا قاعديًا، يُعزى هذا الأمر بشكل أكبر إلى قيود تقنية هلام الأكريلاميد وليس إلى مشكلة في تركيب السلم. وكما هو مُحدد في معظم أدلة مختبرات البيولوجيا الجزيئية (دليل ماناتيس للاستنساخ الجزيئي في كولد سبرينغز هاربور، الطبعة الثانية) وكما أقرّ به مُصنّعو هلام الأكريلاميد، ينبغي إجراء التطبيقات التي تتطلب تحديدًا دقيقًا لأحجام قطع الحمض النووي باستخدام هلام الأغاروز كلما أمكن ذلك. سؤال: هل يُمكنني استخدام صبغة ميدوري الخضراء مع سلالم الحمض النووي من شركة NEB؟ ج: تتوافق سلالم الحمض النووي من NEB، بما في ذلك سلم الحمض النووي Quick-Load Purple 1 kb Plus (NEB #N0550)، مع صبغة Midori Green دون أي تداخل ملحوظ. يُرجى اتباع توصيات الشركة المصنعة للصبغة بدقة. نظرًا لانخفاض شدة الصبغة، قد تحتاج إلى تحميل ما بين 1 و2 ميكروغرام من سلم الحمض النووي لتحقيق رؤية جيدة في ظل ظروف الإضاءة فوق البنفسجية القياسية. س: هل يُمكنني استخدام صبغات SYBR® و/أو GelRed® مع سلالم الحمض النووي من NEB؟ ج: نظرًا لأن الصبغات ذات الألفة العالية لربط الأحماض النووية يُمكن أن تؤثر على هجرة الحمض النووي أثناء الفصل الكهربائي، يُوصى بشدة بتلوين الهلامات بعد الفصل الكهربائي باستخدام صبغات SYBR وGelRed. يُؤدي التلوين بعد الفصل الكهربائي إلى حساسية فائقة ويُزيل احتمال تداخل الصبغة مع هجرة الحمض النووي. على الرغم من إمكانية صب هلامات الأغاروز مسبقًا بهذه الصبغات، إلا أن هجرة و/أو دقة بعض سلالم الحمض النووي قد تتأثر. لذا، قد تتطلب بعض سلالم الحمض النووي تعديلًا أو تخفيفًا عند تشغيلها على هلامات مُجهزة مسبقًا بهذه الأصباغ. وللحصول على أفضل النتائج، يُرجى اتباع توصيات الشركة المصنعة للأصباغ وبروتوكولاتها بدقة، لا سيما فيما يتعلق بكميات التحميل. نوصي باستخدام سلم الحمض النووي 1 كيلوبايت بلس للتلوين الآمن (NEB #N0559) عند استخدام SYBR أو GelRed كأصباغ مُجهزة مسبقًا، حيث تم تحسين سلم الحمض النووي هذا خصيصًا لهذا التطبيق. بالإضافة إلى ذلك، تجنب استخدام أصباغ التحميل التي تحتوي على SDS، لأن SDS قد يتسبب في ظهور نمط نطاقات غير طبيعي في الهلامات المُجهزة مسبقًا. نوصي باستخدام صبغة تحميل الهلام، بنفسجية (6X)، خالية من SDS (NEB #B7025) لهذا التطبيق. س: لماذا يطفو سلم الحمض النووي الخاص بي خارج الآبار؟ ولماذا لا تظهر أي حزم في مسار هلام سلم الحمض النووي؟ ج: إذا تم تجميد سلم الحمض النووي الجاهز للتحميل أو صبغة التحميل 6X المرفقة به في أي وقت، فسيشكل الفيكول تدرجًا في الكثافة داخل القارورة عند إذابته. أي حجم يتم سحبه من أعلى القارورة سيحتوي على كمية صغيرة فقط من عامل الكثافة وسيطفو خارج الآبار. لمنع ذلك، اخلط جيدًا عند الاستلام وقبل الاستخدام. س: هل يمكنني استخدام GelRed® مع سلالم الحمض النووي ذات الوزن الجزيئي المنخفض وسلالم الحمض النووي 50 زوجًا قاعديًا من NEB؟ ج: نعم. يُوصى بشدة باستخدام GelRed للتلوين بعد الفصل الكهربائي للحصول على أفضل أداء. عادةً ما يكون التلوين لمدة 30 دقيقة كافيًا لرؤية شظايا الحمض النووي بشكل صحيح. على الرغم من إمكانية صب هلامات الأغاروز مسبقًا باستخدام GelRed، إلا أن ذلك قد يؤثر على هجرة ودقة سلالم الحمض النووي. وفقًا للشركة المصنعة، يمكن أن تُغير أصباغ ربط الأحماض النووية عالية الألفة من هذه الظاهرة. هجرة الحمض النووي أثناء الفصل الكهربائي. بالنسبة لسلالم الحمض النووي ذات الوزن الجزيئي المنخفض وسلالم الحمض النووي بطول 50 زوجًا قاعديًا تحديدًا، والمكونة من شظايا حمض نووي ذات نهايات لاصقة، فمن المرجح أن تتلطخ حزم السلم عند تحضير الهلام مسبقًا بصبغة GelRed. يؤدي التلوين اللاحق بصبغة GelRed إلى حساسية فائقة ويزيل احتمالية تداخل الصبغة. مع ذلك، ستعمل هذه السلالم كما هو متوقع مع الهلام المحضر مسبقًا إذا خضعت أولًا لمعالجة لتخفيف حدة النهايات (من خلال ملء الفراغات باستخدام البوليميراز أو تفاعل تخفيف حدة النهايات باستخدام النيوكلياز).