نيو إنجلاند بيولابس، N0557S، سلم الحمض النووي ذو الوزن الجزيئي المنخفض Quick-Load® الأرجواني

الفئات ذات الصلة: سلالم الحمض النووي الأرجوانية سريعة التحميل، علامات وسلالم الحمض النووي، تطبيقات تحليل الحمض النووي، المواصفات، القواعد، كتلة القطعة (نانوغرام) زوج قاعدي، 1 42 766، 2 27 500، 3 20 350، 4 33 300، 5 27 250، 6 110 200، 7 33 150، 8 43 100، 9 58 75، 10 63 50، 11 43 25، نطاق الحجم الفعال من 25 إلى 766 زوج قاعدي ، محلول التخزين: 2.5% فيكول®-400، 10 ملي مولار EDTA، 3.3 ملي مولار Tris-HCl، 0.001% صبغة 2، 0.02% صبغة 1، الرقم الهيدروجيني 8 عند 25 درجة مئوية، الأسئلة الشائعة : س: لماذا تظهر حزم إضافية على هلامات البولي أكريلاميد؟ ج: لزيادة وضوح الحزم الأصغر حجمًا وحزم المقارنة، تم استنساخ عدة أجزاء من نفس الحجم في البلازميدات المستخدمة في العديد من سلالم الحمض النووي. هذه الأجزاء، المتطابقة في الحجم، لا يمكن تمييزها على هلام الأغاروز، ولكن على هلام الأكريلاميد، حتى الاختلافات الطفيفة في تسلسل الحمض النووي يمكن أن تؤدي إلى معدلات هجرة مختلفة بشكل ملحوظ. لا تتحرك الأجزاء من نفس الحجم دائمًا بنفس الطريقة على الأكريلاميد. بالنسبة لسلم الحمض النووي 100 زوج قاعدي، فإن الجزأين 500 و517 زوج قاعدي، اللذين يتحركان كزوج متقارب على الأغاروز، ينفصلان بوضوح شديد على الأكريلاميد، حيث يقع الشريط 517 زوج قاعدي تقريبًا في منتصف المسافة بين الجزأين 500 و600 زوج قاعدي. هذه الهجرة "الشاذة" هي سمة متأصلة في الرحلان الكهربائي على هلام الأكريلاميد ولا تشير إلى أي خطأ في الحجم المحدد لأجزاء الحمض النووي في سلمنا. بالنسبة لسلم الحمض النووي ذي 50 زوجًا قاعديًا وسلم الوزن الجزيئي المنخفض، يميل اثنان أو أكثر من الحزم المكونة لحزمة المرجع ذات 200 زوج قاعدي إلى الظهور بشكل مختلف، مما ينتج عنه حزمة إضافية أو أكثر قابلة للكشف حول نطاق 200 زوج قاعدي. وكما هو الحال مع سلم الحمض النووي ذي 100 زوج قاعدي، يُعزى هذا الأمر بشكل أكبر إلى قيود تقنية هلام الأكريلاميد وليس إلى مشكلة في تركيب السلم. وكما هو موضح في معظم أدلة مختبرات البيولوجيا الجزيئية (دليل ماناتيس للاستنساخ الجزيئي في كولد سبرينغز هاربور، الطبعة الثانية) وكما أقرت به الشركات المصنعة لهلام الأكريلاميد، يجب إجراء التطبيقات التي تتطلب تحديدًا دقيقًا لأحجام شظايا الحمض النووي باستخدام هلام الأغاروز كلما أمكن ذلك. س: هل يمكنني استخدام صبغة ميدوري الخضراء مع سلالم الحمض النووي من شركة NEB؟ ج: سلالم الحمض النووي من شركة NEB، بما في ذلك سلم الحمض النووي Quick-Load Purple 1 kb Plus (NEB #N0550)، متوافقة مع صبغة ميدوري الخضراء دون أي تداخل ملحوظ. يُرجى اتباع توصيات الشركة المصنعة للصبغة بدقة. نظرًا لانخفاض كثافة الصبغة، قد تحتاج إلى تحميل ما بين 1 و2 ميكروغرام من سلم الحمض النووي لتحقيق رؤية جيدة في ظل ظروف الإضاءة فوق البنفسجية القياسية. س: هل يمكنني استخدام صبغات SYBR® و/أو GelRed® مع سلالم الحمض النووي من NEB؟ ج: نظرًا لأن الصبغات ذات الألفة العالية لربط الأحماض النووية قد تؤثر على هجرة الحمض النووي أثناء الفصل الكهربائي، يُنصح بشدة بتلوين الهلامات بعد الفصل الكهربائي باستخدام صبغات SYBR وGelRed. يؤدي التلوين بعد الفصل الكهربائي إلى حساسية فائقة ويمنع تداخل الصبغة مع هجرة الحمض النووي. على الرغم من إمكانية تحضير هلامات الأغاروز مسبقًا بهذه الصبغات، إلا أن هجرة و/أو دقة بعض سلالم الحمض النووي قد تتأثر. لذلك، قد تتطلب بعض سلالم الحمض النووي تحسينًا/تخفيفًا عند تشغيلها على هلامات مُحضرة مسبقًا بهذه الصبغات. للحصول على أفضل النتائج، يُرجى اتباع توصيات وبروتوكولات الشركة المصنعة للصبغة بعناية، وخاصة فيما يتعلق بكميات التحميل. نوصي باستخدام سلم الحمض النووي 1 كيلوبايت بلس للتلوين الآمن (NEB #N0559) عند استخدام SYBR أو GelRed كأصباغ جاهزة، حيث تم تحسين هذا السلم خصيصًا لهذا الغرض. بالإضافة إلى ذلك، تجنب استخدام أصباغ التحميل التي تحتوي على SDS، لأن SDS قد يتسبب في ظهور نمط غير طبيعي للشرائط في الهلامات الجاهزة. نوصي باستخدام صبغة تحميل الهلام، بنفسجية (6X)، خالية من SDS (NEB #B7025) لهذا الغرض. س: لماذا يطفو سلم الحمض النووي الخاص بي خارج الآبار؟ ولماذا لا تظهر أي حزم في مسار هلام سلم الحمض النووي؟ ج: إذا تم تجميد سلم الحمض النووي الجاهز للتحميل أو صبغة التحميل 6X المرفقة به في أي وقت، فسيشكل الفيكول تدرجًا في الكثافة داخل القارورة عند إذابته. أي حجم يتم سحبه من أعلى القارورة سيحتوي على كمية صغيرة فقط من عامل الكثافة وسيطفو خارج الآبار. لمنع ذلك، اخلط جيدًا عند الاستلام وقبل الاستخدام. س: هل يمكنني استخدام GelRed® مع سلالم الحمض النووي ذات الوزن الجزيئي المنخفض وسلالم الحمض النووي 50 زوجًا قاعديًا من NEB؟ ج: نعم. يُوصى بشدة باستخدام GelRed للتلوين بعد الفصل الكهربائي للحصول على أفضل أداء. عادةً ما يكون التلوين لمدة 30 دقيقة كافيًا لرؤية شظايا الحمض النووي بشكل صحيح. على الرغم من إمكانية صب هلامات الأغاروز مسبقًا باستخدام GelRed، إلا أن ذلك قد يؤثر على هجرة ودقة سلالم الحمض النووي. وفقًا للشركة المصنعة، يمكن أن تُغير أصباغ ربط الأحماض النووية عالية الألفة من هذه الظاهرة. هجرة الحمض النووي أثناء الفصل الكهربائي. بالنسبة لسلالم الحمض النووي ذات الوزن الجزيئي المنخفض وسلالم الحمض النووي بطول 50 زوجًا قاعديًا تحديدًا، والمكونة من شظايا حمض نووي ذات نهايات لاصقة، فمن المرجح أن تتلطخ حزم السلم عند تحضير الهلام مسبقًا بصبغة GelRed. يؤدي التلوين اللاحق بصبغة GelRed إلى حساسية فائقة ويزيل احتمالية تداخل الصبغة. مع ذلك، ستعمل هذه السلالم كما هو متوقع مع الهلام المحضر مسبقًا إذا خضعت أولًا لمعالجة لتخفيف حدة النهايات (من خلال ملء الفراغات باستخدام البوليميراز أو تفاعل تخفيف حدة النهايات باستخدام النيوكلياز).