مختبرات نيو إنجلاند بيولابس، N3012S، هضم الحمض النووي لامدا باستخدام إنزيم هيند III

الفئات ذات الصلة: علامات وسلالم الحمض النووي، التطبيقات، تحليل الحمض النووي، المواصفات، القواعد، كتلة القطعة (نانوغرام)، زوج قاعدي ، 1، 477، 23130، 2، 194، 9416، 3، 135، 6557، 4، 90، 4361، 5، 48، 2322، 6، 42، 2027، 7، 12، 564، 8، 3، 125، نطاق الحجم الفعال: من 125 إلى 23130 زوج قاعدي، محلول التخزين: 10 ملي مولار Tris-HCl، 1 ملي مولار EDTA، درجة الحموضة 8 عند 25 درجة مئوية، الأسئلة الشائعة : س: ما هي النهايات البارزة على قطع سلم الحمض النووي؟ هل يمكنني وسمها باستخدام كيناز عديد النوكليوتيد T4 (PNK)؟ ماذا عن قطعة Klenow؟ أ: جميع القطع في سلالم الحمض النووي ذات الوزن الجزيئي المنخفض (1 كيلوبايت، 100 زوج قاعدي، 1 كيلوبايت بلس، 50 زوج قاعدي) وعلامة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لها نهايات بارزة 5' يمكن وسمها باستخدام إنزيم T4 PNK (NEB# M0201) أو ملؤها باستخدام جزء كلينو (NEB# M0212). يمكن إجراء الوسم باستخدام PNK باتباع البروتوكول القياسي لإزالة مجموعات الفوسفات الموجودة من نهايات القطع باستخدام إنزيم CIP أو فوسفاتاز القطب الجنوبي، ولكننا حصلنا أيضًا على نتائج ممتازة باستخدام تفاعل "التبادل" الأبسط بكثير، والذي يستغل قدرة الكيناز على إزالة الفوسفات الموجودة من الحمض النووي واستبدالها بفوسفات موسوم. الإجراء الذي أثبت فعاليته لدينا هو كالتالي: - 1 ميكرولتر من T4 PNK - 1 ميكرولتر من 32P ATP (3000 كوري/مليمول، 5 ملي كوري/مل) - 2 ميكرولتر من محلول منظم T4 PNK بتركيز 10x - 1 أو 2 ميكرولتر من سلم الحمض النووي (1 ميكروغرام). يُضاف الماء المقطر حتى يصل الحجم إلى 20 ميكرولتر. يُجرى التفاعل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تُشغل العينات لمدة 50 إلى 60 دقيقة عند جهد 100 فولت في محلول منظم TBE على هلام أكريلاميد بتركيز 4-20% (10 سم × 10 سم). يُعطي التعريض لمدة 20 دقيقة إشارات واضحة جدًا. تبلغ قوة الإشارة ضعف قوة الإشارة تقريبًا عند إضافة ADP بتركيز 100 ميكرومول. س: كيف يمكنني تحديد كمية الحمض النووي في كل حزمة من علامات الحمض النووي؟ ج: يمكن تحديد كمية الحمض النووي في كل حزمة بقسمة حجم الحزمة (بالأزواج القاعدية) على حجم جزيء الحمض النووي غير المقطوع (بالأزواج القاعدية)، ثم ضرب الناتج في إجمالي كمية الحمض النووي المُحمّل على الهلام (بالميكروغرام). س: كيف أستخدم هضم الحمض النووي لامدا-هيند III؟ ج: نوصي بتحميل 1 ميكروغرام (2 ميكرولتر) من الحمض النووي لامدا-هيند III. يمكن فصل الشظايا بكفاءة على هلامات الأغاروز بتركيز يتراوح بين 0.6% و1% باستخدام محاليل TBE أو TAE. لتحضير العينات، ضع 2 ميكرولتر من الحمض النووي في 13 ميكرولتر من محلول TE (10 ملي مولار Tris-HCl، 1 ملي مولار EDTA)، وأضف 3 ميكرولتر من محلول التحميل 6X ليصل الحجم النهائي إلى 18 ميكرولتر. سخّن العينات إلى 60 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، ثم أخرجها وضعها على الثلج أو حمّلها فورًا على الهلام. تحميل أكثر من 1 ميكروغرام سيؤدي إلى ظهور الحزم الأكبر حجمًا عريضة جدًا، مما يجعل استخدامها لتحديد الحجم بدقة أكثر صعوبة. يؤدي تحميل كمية أقل من 0.5 ميكروغرام إلى صعوبة رؤية الحزم الصغيرة. س: لماذا يظهر مؤشر الوزن الجزيئي لـ Lambda DNA الخاص بي مشوشًا ولا يُظهر نمط الحزم الصحيح؟ ج: تنتج هذه التشوهات في الحزم غالبًا عن تحضير مؤشر الوزن الجزيئي للحمض النووي DNA للرحلان الكهربائي. على سبيل المثال، تتطلب مؤشرات Lambda DNA (هضم Hind III وBstE II) تسخينًا قصيرًا قبل الرحلان الكهربائي (نوصي بتسخينها لمدة 3 دقائق عند 60 درجة مئوية، ثم وضعها على الثلج أو تحميلها مباشرة على الهلام) لفصل النهايات اللاصقة المكونة من 12 قاعدة. بدون هذا التسخين، تتحد الحزمة 23 كيلوبايت والحزمة 4.3 كيلوبايت من Lambda-Hind III عن طريق الروابط الهيدروجينية بين القواعد المتكاملة لتشكيل حزمة 27 كيلوبايت. بصريًا، ينتج عن ذلك انخفاض في شدة الحزمة 4.3 كيلوبايت. بدون تسخين لامدا DNA-BstE II، تتحد الحزمتان 8.4 كيلوبايت و5.6 كيلوبايت لتشكيل حزمة واحدة بطول 14 كيلوبايت. ينتج عن ذلك انخفاض في شدة الحزمتين 8.4 و5.6 كيلوبايت، بالإضافة إلى ظهور حزمة واحدة بطول 14 كيلوبايت. من محاذير تسخين علامات الحمض النووي أن الحمض النووي ثنائي السلاسل يتطلب حدًا أدنى من القوة الأيونية لمنعه من التفكك. قد يؤدي هذا التفكك إلى أنماط حزم غير منتظمة أو ضبابية. لذلك، لا نوصي بتخفيف علامات الحمض النووي في الماء، بل في محلول منظم ذي قوة أيونية منخفضة، مثل محلول TE المنظم. سؤال: هل يمكنني استخدام صبغة ميدوري الخضراء مع سلالم الحمض النووي من NEB؟ جواب: سلالم الحمض النووي من NEB، بما في ذلك سلم الحمض النووي Quick-Load Purple 1 kb Plus (NEB #N0550)، متوافقة مع صبغة ميدوري الخضراء دون أي تداخل ملحوظ. يُرجى اتباع توصيات الشركة المصنعة للصبغة بدقة. نظرًا لانخفاض كثافة الصبغة، قد تحتاج إلى تحميل ما بين 1 و2 ميكروغرام من سلم الحمض النووي لتحقيق رؤية جيدة في ظل ظروف الإضاءة فوق البنفسجية القياسية. س: هل يمكنني استخدام صبغات SYBR® و/أو GelRed® مع سلالم الحمض النووي من NEB؟ ج: نظرًا لأن الصبغات ذات الألفة العالية لربط الأحماض النووية قد تؤثر على هجرة الحمض النووي أثناء الفصل الكهربائي، يُنصح بشدة بتلوين الهلامات بعد الفصل الكهربائي باستخدام صبغات SYBR وGelRed. يؤدي التلوين بعد الفصل الكهربائي إلى حساسية فائقة ويمنع تداخل الصبغة مع هجرة الحمض النووي. على الرغم من إمكانية تحضير هلامات الأغاروز مسبقًا بهذه الصبغات، إلا أن هجرة و/أو دقة بعض سلالم الحمض النووي قد تتأثر. لذلك، قد تتطلب بعض سلالم الحمض النووي تحسينًا/تخفيفًا عند تشغيلها على هلامات مُحضرة مسبقًا بهذه الصبغات. للحصول على أفضل النتائج، يُرجى اتباع توصيات وبروتوكولات الشركة المصنعة للصبغة بعناية، وخاصة فيما يتعلق بكميات التحميل. نوصي باستخدام سلم الحمض النووي 1 كيلوبايت بلس للتلوين الآمن (NEB #N0559) عند استخدام SYBR أو GelRed كأصباغ جاهزة، حيث تم تحسين سلم الحمض النووي هذا خصيصًا لهذا التطبيق. بالإضافة إلى ذلك، تجنب استخدام أصباغ التحميل التي تحتوي على SDS، لأن SDS قد يتسبب في ظهور نمط غير طبيعي للحزم في الهلامات الجاهزة. نوصي باستخدام صبغة تحميل الهلام، بنفسجية (6X)، خالية من SDS (NEB #B7025) لهذا التطبيق. س: لماذا يطفو سلم الحمض النووي الخاص بي خارج الآبار؟ لماذا لا تظهر أي حزم في مسار هلام سلم الحمض النووي الخاص بي؟ ج: إذا تم تجميد سلم الحمض النووي الجاهز للتحميل أو صبغة التحميل 6X المرفقة مع السلم في أي وقت، فسيشكل محلول فيكول تدرجًا في الكثافة في القارورة عند إذابته. أي حجم يتم سحبه بالماصة من أعلى القارورة سيحتوي فقط على كمية صغيرة من عامل الكثافة وسيطفو خارج الآبار. لمنع ذلك، اخلط جيدًا عند الاستلام وقبل الاستخدام.