نيو إنجلاند بيولابس، N3019S، مزيج قطع أحادي لـ λ DNA

الفئات ذات الصلة: علامات وسلالم الحمض النووي، التطبيقات، تحليل الحمض النووي، المواصفات، القواعد، كتلة القطعة (نانوغرام)، زوج قاعدي، 1، 100، 48502، 2، 79، 38416، 3، 69، 33498، 4، 62، 29946، 5، 51، 24508، 6، 49، 23994، 7، 35، 17053، 8، 31، 15004، 9، 21، 10086، 10، 3، 1503 ، نطاق الحجم الفعال: من 1503 إلى 48502 زوج قاعدي، محلول التخزين: 10 ملي مولار Tris-HCl، 1 ملي مولار EDTA، درجة الحموضة 8 عند 25 درجة مئوية، الأسئلة الشائعة : س: كيف يمكنني تحديد كمية الحمض النووي في كل شريط من العلامة؟ ج: يمكن تحديد كمية الحمض النووي في كل حزمة بقسمة حجم الحزمة (بالأزواج القاعدية) على حجم جزيء الحمض النووي غير المقطوع (بالأزواج القاعدية)، ثم ضرب الناتج في إجمالي كمية علامة الحمض النووي المحملة على الهلام (بالميكروغرام). س: معلومات عامة عن مزيج لامدا دي إن إيه أحادي القطع: ج: يتطلب مزيج لامدا دي إن إيه أحادي القطع إما الفصل الكهربائي الهلامي النبضي أو، للفصل الكهربائي الهلامي العادي، هلام أجاروز TAE بنسبة منخفضة جدًا لفصل القطع بكفاءة. من الأخطاء الشائعة تشغيل الهلام بسرعة كبيرة، أو استخدام نسبة خاطئة من الأجاروز، أو استخدام محلول منظم خاطئ، أو تحميل كمية كبيرة جدًا من العلامة. بالنسبة للفصل الكهربائي الهلامي النبضي على نظام CHEF، نوصي باستخدام هلام أجاروز بنسبة 1% في محلول منظم TBE بتركيز 0.5x، والذي يجب تشغيله مع نظام تبريد، مع زيادة أوقات النبض تدريجيًا من 0.5 إلى 1.5 ثانية، لمدة 20 ساعة، عند درجة حرارة 15 درجة مئوية، وجهد 6 فولت/سم (حوالي 200 فولت). لإجراء الفصل الكهربائي الهلامي التقليدي، استخدم الشروط التالية: 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي أحادي القطع، هلام أجاروز بتركيز 0.4% في محلول منظم TAE بتركيز 1x، 10 فولت، درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة. يجب تشغيل الهلام ببطء شديد لفصل القطع الكبيرة. إضافة بروميد الإيثيديوم إلى الهلام ومحلول التشغيل بتركيز نهائي 0.5 ميكروغرام/مل سيصبغ الحزم بفعالية أثناء الفصل الكهربائي. س: هل يمكنني استخدام صبغة ميدوري الخضراء مع سلالم الحمض النووي من NEB؟ ج: سلالم الحمض النووي من NEB، بما في ذلك سلم الحمض النووي Quick-Load Purple 1 kb Plus (NEB #N0550)، متوافقة مع صبغة ميدوري الخضراء دون أي تداخل. يرجى اتباع توصيات الشركة المصنعة للصبغة بدقة. نظرًا لانخفاض شدة الصبغة، قد تحتاج إلى تحميل ما بين 1 و2 ميكروغرام من سلم الحمض النووي للحصول على رؤية جيدة في ظل ظروف الإضاءة فوق البنفسجية القياسية. س: هل يمكنني استخدام صبغات SYBR® و/أو GelRed® مع سلالم الحمض النووي من NEB؟ ج: نظرًا لأن الصبغات ذات الألفة العالية لربط الأحماض النووية قد تؤثر على هجرة الحمض النووي أثناء الفصل الكهربائي، يُنصح بشدة بتلوين الهلامات بعد الفصل الكهربائي باستخدام صبغات SYBR وGelRed. يؤدي التلوين بعد الفصل الكهربائي إلى حساسية فائقة ويمنع تداخل الصبغة مع هجرة الحمض النووي. مع أن هلامات الأغاروز يمكن طلاؤها مسبقًا بهذه الصبغات، إلا أن هجرة و/أو دقة بعض سلالم الحمض النووي قد تتأثر. لذلك، قد تتطلب بعض سلالم الحمض النووي تعديلًا/تخفيفًا عند تشغيلها على هلامات مطلية مسبقًا بهذه الصبغات. للحصول على أفضل النتائج، يُرجى اتباع توصيات وبروتوكولات الشركة المصنعة للصبغة بدقة، وخاصةً فيما يتعلق بكميات التحميل. نوصي باستخدام سلم الحمض النووي 1 كيلوبايت بلس للتلوين الآمن (NEB #N0559) عند استخدام SYBR أو GelRed كصبغات مطلية مسبقًا، حيث تم تحسين سلم الحمض النووي هذا خصيصًا لهذا التطبيق. بالإضافة إلى ذلك، تجنب استخدام أصباغ التحميل التي تحتوي على كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)، لأن SDS قد يتسبب في ظهور نمط غير طبيعي للشرائط في الهلامات الجاهزة. نوصي باستخدام صبغة تحميل الهلام، بنفسجية (6X)، خالية من SDS (NEB #B7025) لهذا التطبيق. س: لماذا يطفو سلم الحمض النووي الخاص بي خارج الآبار؟ لماذا لا تظهر أي حزم في مسار هلام سلم الحمض النووي؟ ج: إذا تم تجميد سلم الحمض النووي الجاهز للتحميل أو صبغة التحميل 6X المرفقة به في أي وقت، فسيتشكل تدرج كثافة في محلول الفيكول داخل القارورة عند إذابته. أي حجم يتم سحبه من أعلى القارورة سيحتوي على كمية صغيرة فقط من عامل الكثافة وسيطفو خارج الآبار. لمنع ذلك، اخلط جيدًا عند الاستلام وقبل الاستخدام. س: لماذا أحصل على نتائج ضعيفة عند تشغيل علامة PFG على هلام المجال النبضي؟ ج: هناك عدة عوامل تؤدي إلى نتائج ضعيفة لعلامات PFG. إليك قائمة بالتوصيات لضمان الحصول على نمط حزم واضح وعالي الجودة: استخدم نظام Chef DR-II مع شبكة سداسية بزاوية 120 درجة (لا تستخدم عكس المجال، 180 درجة). استخدم محلول TBE طازجًا بتركيز 0.5X لمحلول التشغيل والهلام. استخدم ماءً عالي الجودة (Milli-Q) لتحضير المحلول والهلام. ضع المؤشر على شكل سدادة صلبة (لا تقم بإذابة السدادة أبدًا). ​​ضع شريحة رقيقة من المؤشر، بحجم تدريج واحد تقريبًا، على المحقنة (السدادة السميكة ستؤدي إلى تحميل البئر بكمية زائدة من الحمض النووي، مما ينتج عنه نمط مشوش وغير واضح). شغّل دائمًا البرنامج الموصى به لكل مؤشر على حدة. البرامج مُحسَّنة لفصل الحزم ضمن نطاق الحجم المُناسب لكل مؤشر. غالبًا ما يؤدي تبديل البرامج مع مؤشرات مختلفة إلى دقة منخفضة. خزّن المؤشر عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.