مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، N3031L، هضم الحمض النووي pBR322-BstNI

الفئات ذات الصلة: علامات وسلالم الحمض النووي، التطبيقات، تحليل الحمض النووي، المواصفات، القواعد، كتلة القطعة (نانوغرام)، زوج قاعدي ، 1، 426، 1857، 2، 243، 1058، 3، 213، 929، 4، 88، 383، 5، 28، 121، 6، 3، 13، نطاق الحجم الفعال : من 13 إلى 1857 زوج قاعدي، محلول التخزين: 10 ملي مولار Tris-HCl، 1 ملي مولار EDTA، درجة الحموضة 8 عند 25 درجة مئوية، الأسئلة الشائعة: س: لماذا فصل الحزم السفلية غير مكتمل؟ ج: تحتوي السلالم ذات الوزن الجزيئي المنخفض على شظايا صغيرة وتتطلب أوقات تشغيل طويلة لفصل الحزم بفعالية. لتصوير الحزم الأصغر، يُفضل استخدام هلام بنسبة أعلى (حتى 3% أجاروز، والذي يتم إجراؤه بشكل أكثر فعالية باستخدام أجاروز منخفض الذوبان مُصمم خصيصًا). تميل الحزم الأصغر حجمًا إلى الانتشار بشكل أكبر من الحزم الأكبر حجمًا أثناء عملية الفصل الكهربائي، لذا فإن التشغيل بسرعة أكبر (بجهد أعلى) قد يكون مفيدًا، طالما لم يتم توليد حرارة زائدة. في معظم الأنظمة، يمكن تشغيل الهلامات بنسبة 2% أو أعلى عند جهد 200 فولت لعدة ساعات دون حدوث تلف حراري مفرط. س: ما هي النهايات البارزة على قطع سلم الحمض النووي؟ هل يمكنني وسمها باستخدام إنزيم T4 بولينوكليوتيد كيناز (PNK)؟ ماذا عن قطعة كلينو؟ ج: جميع القطع في سلالم الحمض النووي 1 كيلوبايت، و100 زوج قاعدي، و1 كيلوبايت بلس، و50 زوج قاعدي، وسلالم الحمض النووي منخفضة الوزن الجزيئي، وعلامة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لها نهايات بارزة 5' يمكن وسمها باستخدام إنزيم T4 PNK (NEB# M0201) أو ملؤها باستخدام قطعة كلينو (NEB# M0212). يمكن وسم الحمض النووي باستخدام إنزيم PNK باتباع البروتوكول القياسي لإزالة مجموعات الفوسفات الموجودة من نهايات القطع باستخدام إنزيم CIP أو فوسفاتاز القطب الجنوبي، ولكننا حصلنا أيضًا على نتائج ممتازة باستخدام تفاعل "التبادل" الأبسط بكثير، والذي يستغل قدرة الكيناز على إزالة الفوسفات الموجودة من الحمض النووي واستبدالها بفوسفات موسوم. الإجراء الذي حقق أفضل النتائج لدينا هو كالتالي: - 1 ميكرولتر من إنزيم T4 PNK - 1 ميكرولتر من 32P ATP (3000 كوري/مليمول، 5 ملي كوري/مل) - 2 ميكرولتر من محلول منظم T4 PNK بتركيز 10x - 1 أو 2 ميكرولتر من سلم الحمض النووي (1 ميكروغرام). يُضاف الماء المقطر حتى يصل الحجم إلى 20 ميكرولتر. يُجرى التفاعل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تُفصل العينات لمدة 50 إلى 60 دقيقة عند جهد 100 فولت في محلول منظم TBE على هلام أكريلاميد بنسبة 4-20% (10 سم × 10 سم). يُعطي التعريض لمدة 20 دقيقة إشارات واضحة للغاية. وتتضاعف قوة الإشارة تقريبًا عند إضافة ADP بتركيز 100 ميكرومول. س: كيف يُمكنني تحديد كمية الحمض النووي في كل حزمة من علامات الحمض النووي؟ ج: يُمكن تحديد كمية الحمض النووي في كل حزمة بقسمة حجم الحزمة (بالأزواج القاعدية) على حجم جزيء الحمض النووي غير المقطوع (بالأزواج القاعدية)، ثم ضرب الناتج في إجمالي كمية علامات الحمض النووي المحملة على الهلام (بالميكروغرام). س: هل يُمكنني استخدام صبغة ميدوري الخضراء مع سلالم الحمض النووي من شركة NEB؟ ج: سلالم الحمض النووي من NEB، بما في ذلك سلم الحمض النووي Quick-Load Purple 1 kb Plus (NEB #N0550)، متوافقة مع صبغة ميدوري الخضراء دون أي تداخل. يُرجى اتباع توصيات الشركة المصنعة للصبغة بدقة. نظرًا لانخفاض شدة الصبغة، قد تحتاج إلى تحميل ما بين 1 و2 ميكروغرام من سلم الحمض النووي للحصول على رؤية جيدة في ظل ظروف الإضاءة فوق البنفسجية القياسية. س: هل يمكنني استخدام صبغات SYBR® و/أو GelRed® مع سلالم الحمض النووي من NEB؟ ج: نظرًا لأن الصبغات ذات الألفة العالية لربط الأحماض النووية قد تؤثر على هجرة الحمض النووي أثناء الفصل الكهربائي، يُنصح بشدة بتلوين الهلامات بعد الفصل الكهربائي باستخدام صبغات SYBR وGelRed. يؤدي التلوين بعد الفصل الكهربائي إلى حساسية فائقة ويمنع تداخل الصبغة مع هجرة الحمض النووي. مع أن هلامات الأغاروز يمكن طلاؤها مسبقًا بهذه الصبغات، إلا أن هجرة و/أو دقة بعض سلالم الحمض النووي قد تتأثر. لذلك، قد تتطلب بعض سلالم الحمض النووي تعديلًا/تخفيفًا عند تشغيلها على هلامات مطلية مسبقًا بهذه الصبغات. للحصول على أفضل النتائج، يُرجى اتباع توصيات وبروتوكولات الشركة المصنعة للصبغة بدقة، وخاصةً فيما يتعلق بكميات التحميل. نوصي باستخدام سلم الحمض النووي 1 كيلوبايت بلس للتلوين الآمن (NEB #N0559) عند استخدام SYBR أو GelRed كصبغات مطلية مسبقًا، حيث تم تحسين سلم الحمض النووي هذا خصيصًا لهذا التطبيق. بالإضافة إلى ذلك، تجنب استخدام أصباغ التحميل التي تحتوي على كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)، لأن SDS قد يتسبب في ظهور نمط غير طبيعي للأشرطة في الهلامات الجاهزة. نوصي باستخدام صبغة تحميل الهلام، بنفسجية (6X)، خالية من SDS (NEB #B7025) لهذا التطبيق. س: لماذا يطفو سلم الحمض النووي الخاص بي خارج الآبار؟ لماذا لا تظهر أي أشرطة في مسار هلام سلم الحمض النووي الخاص بي؟ ج: إذا تم تجميد سلم الحمض النووي الجاهز للتحميل أو صبغة التحميل 6X المرفقة مع السلم في أي وقت، فسيشكل محلول الفيكول تدرجًا في الكثافة في القارورة عند إذابته. أي حجم يتم سحبه بالماصة من أعلى القارورة سيحتوي فقط على كمية صغيرة من عامل الكثافة وسيطفو خارج الآبار. لمنع ذلك، اخلط جيدًا عند الاستلام وقبل الاستخدام.