نيو إنجلاند بيولابس، N3032S، هضم الحمض النووي pBR322 بواسطة إنزيم MspI

تم إيقاف إنتاج الحجم الكبير من هذا المنتج في 31/12/2020. وسيظل الحجم الصغير متوفراً. الفئات ذات الصلة: علامات وسلالم الحمض النووي، التطبيقات، تحليل الحمض النووي، المواصفات، القواعد، كتلة القطعة (نانوغرام)، زوج قاعدي ، 1 143 622، 2 121 527، 3 93 404، 4 70 307، 5 55 242، 6 55 238، 7 50 217، 8 46 201، 9 44 190، 10 41 180، 11 74 160/160، 12 68 147/147، 13 28 123، 14 25 110، 15 21 90، 16 17 76، 17 15 67، 18 16 34/34، 19 12 26/26، 20 3 15 21، 4 9/9، نطاق الحجم الفعال من 9 أزواج قاعدية إلى محلول تخزين 622bp، 10 ملي مولار Tris-HCl، 1 ملي مولار EDTA، درجة الحموضة 8 عند 25 درجة مئوية. الأسئلة الشائعة : س: لماذا فصل الحزم السفلية غير مكتمل؟ ج: تحتوي سلالم الحمض النووي ذات الوزن الجزيئي المنخفض على شظايا صغيرة، وتتطلب أوقات تشغيل طويلة لفصل الحزم بفعالية. لتصوير الحزم الأصغر، يُفضل استخدام هلام ذي نسبة أعلى (حتى 3% أجاروز، ويُفضل استخدام أجاروز منخفض الذوبان مُصمم خصيصًا). تميل الحزم الأصغر أيضًا إلى الانتشار أكثر من الحزم الأكبر أثناء عملية الفصل الكهربائي، لذا قد يكون التشغيل بسرعة أكبر (بجهد أعلى) مفيدًا، طالما لم يتم توليد حرارة زائدة. في معظم الأنظمة، يمكن تشغيل هلامات بنسبة 2% أو أعلى بجهد 200 فولت لعدة ساعات دون حدوث تلف حراري مفرط. س: ما هي النهايات المتدلية على شظايا سلم الحمض النووي؟ هل يمكنني وسمها باستخدام إنزيم T4 بولينوكليوتيد كيناز (PNK)؟ ماذا عن شظية كلينو؟ أ: جميع القطع في سلالم الحمض النووي ذات الوزن الجزيئي المنخفض (1 كيلوبايت، 100 زوج قاعدي، 1 كيلوبايت بلس، 50 زوج قاعدي) وعلامة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لها نهايات بارزة 5' يمكن وسمها باستخدام إنزيم T4 PNK (NEB# M0201) أو ملؤها باستخدام جزء كلينو (NEB# M0212). يمكن إجراء الوسم باستخدام PNK باتباع البروتوكول القياسي لإزالة مجموعات الفوسفات الموجودة من نهايات القطع باستخدام إنزيم CIP أو فوسفاتاز القطب الجنوبي، ولكننا حصلنا أيضًا على نتائج ممتازة باستخدام تفاعل "التبادل" الأبسط بكثير، والذي يستغل قدرة الكيناز على إزالة الفوسفات الموجودة من الحمض النووي واستبدالها بفوسفات موسوم. الإجراء الذي أثبت فعاليته لدينا هو كالتالي: - 1 ميكرولتر من T4 PNK - 1 ميكرولتر من 32P ATP (3000 كوري/مليمول، 5 ملي كوري/مل) - 2 ميكرولتر من محلول منظم T4 PNK بتركيز 10x - 1 أو 2 ميكرولتر من سلم الحمض النووي (1 ميكروغرام). يُضاف الماء المقطر حتى يصل الحجم إلى 20 ميكرولتر. يُجرى التفاعل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تُشغل العينات لمدة 50 إلى 60 دقيقة عند جهد 100 فولت في محلول منظم TBE على هلام أكريلاميد بتركيز 4-20% (10 سم × 10 سم). يُعطي التعريض لمدة 20 دقيقة إشارات واضحة جدًا. تبلغ قوة الإشارة ضعف قوة الإشارة تقريبًا عند إضافة ADP بتركيز 100 ميكرومول. س: كيف يمكنني تحديد كمية الحمض النووي في كل حزمة من علامات الحمض النووي؟ ج: يمكن تحديد كمية الحمض النووي في كل حزمة بقسمة حجم الحزمة (بالأزواج القاعدية) على حجم جزيء الحمض النووي غير المقطوع (بالأزواج القاعدية)، ثم ضرب الناتج في إجمالي كمية علامة الحمض النووي المحملة على الهلام (بالميكروغرام). س: هل يمكنني استخدام صبغة ميدوري الخضراء مع سلالم الحمض النووي من شركة NEB؟ ج: سلالم الحمض النووي من NEB، بما في ذلك سلم الحمض النووي Quick-Load Purple 1 kb Plus (NEB #N0550)، متوافقة مع صبغة ميدوري الخضراء دون أي تداخل. يُرجى اتباع توصيات الشركة المصنعة للصبغة بدقة. نظرًا لانخفاض شدة الصبغة، قد تحتاج إلى تحميل ما بين 1 و2 ميكروغرام من سلم الحمض النووي للحصول على رؤية جيدة في ظل ظروف الإضاءة فوق البنفسجية القياسية. س: هل يمكنني استخدام صبغات SYBR® و/أو GelRed® مع سلالم الحمض النووي من NEB؟ ج: نظرًا لأن صبغات ربط الأحماض النووية ذات الألفة العالية قد تؤثر على هجرة الحمض النووي أثناء الفصل الكهربائي، يُنصح بشدة بتلوين الهلامات بصبغات SYBR وGelRed بعد الفصل. يؤدي التلوين بعد الفصل الكهربائي إلى حساسية فائقة ويمنع تداخل الصبغة مع هجرة الحمض النووي. مع أن هلامات الأغاروز يمكن تحضيرها مسبقًا بهذه الصبغات، إلا أن هجرة و/أو فصل بعض سلالم الحمض النووي قد يتأثر. لذا، قد تتطلب بعض سلالم الحمض النووي تعديلًا/تخفيفًا عند تشغيلها على هلامات محضرة مسبقًا بهذه الصبغات. للحصول على أفضل النتائج، يُرجى اتباع توصيات وبروتوكولات الشركة المصنعة للصبغة بدقة، وخاصةً فيما يتعلق بكميات التحميل. نوصي باستخدام سلم الحمض النووي 1 كيلوبايت بلس للتلوين الآمن (NEB #N0559) عند استخدام SYBR أو GelRed كصبغات محضرة مسبقًا، حيث تم تحسين سلم الحمض النووي هذا خصيصًا لهذا التطبيق. بالإضافة إلى ذلك، تجنب استخدام صبغات التحميل التي تحتوي على SDS، لأن SDS قد يتسبب في ظهور نمط نطاقات غير طبيعي في الهلامات المحضرة مسبقًا. نوصي باستخدام صبغة تحميل الهلام، بنفسجي (6X)، بدون SDS (NEB #B7025) لهذا التطبيق. س: لماذا يطفو سلم الحمض النووي الخاص بي خارج الآبار؟ ولماذا لا تظهر أي حزم في مسار هلام سلم الحمض النووي؟ ج: إذا تم تجميد سلم الحمض النووي الجاهز للتحميل أو صبغة التحميل 6X المرفقة به في أي وقت، فسيتشكل تدرج كثافة في محلول الفيكول داخل القارورة عند إذابته. أي حجم يتم سحبه من أعلى القارورة سيحتوي على كمية صغيرة فقط من عامل الكثافة، وبالتالي سيطفو خارج الآبار. لمنع ذلك، يُرجى خلطه جيدًا عند الاستلام وقبل الاستخدام.