نيو إنجلاند بيولابس، N3231S، سلم الحمض النووي 100 زوج قاعدي

الفئات ذات الصلة: علامات وسلالم الحمض النووي، التطبيقات، تحليل الحمض النووي، المواصفات ، القواعد، كتلة القطعة (نانوغرام) زوج قاعدي، 1 45 1517، 2 35 1200، 3 95 1000، 4 27 900، 5 24 800، 6 21 700، 7 18 600، 8 97 500/517، 9 38 400، 10 29 300، 11 25 200، 12 48 100، نطاق الحجم الفعال من 100 إلى 1517 زوج قاعدي ، محلول التخزين: 10 ملي مولار Tris-HCl، 1 ملي مولار EDTA، الرقم الهيدروجيني 8 عند 25 درجة مئوية، الأسئلة الشائعة : س: لماذا تظهر حزم إضافية على هلامات البولي أكريلاميد؟ ج: لزيادة وضوح الحزم الأصغر حجمًا وحزم المقارنة، تم استنساخ عدة أجزاء من نفس الحجم في البلازميدات المستخدمة في العديد من سلالم الحمض النووي. هذه الأجزاء، المتطابقة في الحجم، لا يمكن تمييزها على هلام الأغاروز، ولكن على هلام الأكريلاميد، حتى الاختلافات الطفيفة في تسلسل الحمض النووي يمكن أن تؤدي إلى معدلات هجرة مختلفة بشكل ملحوظ. لا تتحرك الأجزاء من نفس الحجم دائمًا بنفس الطريقة على الأكريلاميد. بالنسبة لسلم الحمض النووي 100 زوج قاعدي، فإن الجزأين 500 و517 زوج قاعدي، اللذين يتحركان كزوج متقارب على الأغاروز، ينفصلان بوضوح شديد على الأكريلاميد، حيث يقع الشريط 517 زوج قاعدي تقريبًا في منتصف المسافة بين الجزأين 500 و600 زوج قاعدي. هذه الهجرة "الشاذة" هي سمة متأصلة في الرحلان الكهربائي على هلام الأكريلاميد ولا تشير إلى أي خطأ في الحجم المحدد لأجزاء الحمض النووي في سلمنا. بالنسبة لسلم الحمض النووي ذي 50 زوجًا قاعديًا وسلم الوزن الجزيئي المنخفض، يميل اثنان أو أكثر من الحزم المكونة لحزمة المرجع ذات 200 زوج قاعدي إلى الظهور بشكل مختلف، مما ينتج عنه حزمة إضافية أو أكثر قابلة للكشف حول نطاق 200 زوج قاعدي. وكما هو الحال مع سلم الحمض النووي ذي 100 زوج قاعدي، يُعزى هذا الأمر بشكل أكبر إلى قيود تقنية هلام الأكريلاميد وليس إلى مشكلة في تركيب السلم. وكما هو موضح في معظم أدلة مختبرات البيولوجيا الجزيئية (دليل ماناتيس للاستنساخ الجزيئي في كولد سبرينغز هاربور، الطبعة الثانية) وكما أقرّ به مصنّعو هلام الأكريلاميد، ينبغي إجراء التطبيقات التي تتطلب تحديدًا دقيقًا لأحجام شظايا الحمض النووي باستخدام هلام الأغاروز كلما أمكن ذلك. س: لماذا فصل الحزم السفلية غير مكتمل؟ ج: تحتوي سلالم الوزن الجزيئي المنخفض على شظايا صغيرة وتتطلب أوقات تشغيل طويلة لفصل الحزم بفعالية. لتصوير الحزم الأصغر، يُفضّل استخدام هلام ذي نسبة أعلى (حتى 3% أجاروز، ويُفضّل استخدام أجاروز منخفض الذوبان مُصمّم خصيصًا). تميل الحزم الأصغر أيضًا إلى الانتشار أكثر من الحزم الأكبر أثناء عملية الفصل الكهربائي، لذا قد يكون التشغيل بسرعة أكبر (بجهد أعلى) مفيدًا، شريطة عدم توليد حرارة زائدة. في معظم الأنظمة، يمكن تشغيل هلامات بنسبة 2% أو أعلى بجهد 200 فولت لعدة ساعات دون حدوث تلف حراري مفرط. س: ما هي النهايات المتدلية على قطع سلم الحمض النووي؟ هل يمكنني وسمها باستخدام إنزيم كيناز عديد النوكليوتيد T4 (PNK)؟ ماذا عن قطعة كلينو؟ أ: جميع القطع في سلالم الحمض النووي ذات الوزن الجزيئي المنخفض (1 كيلوبايت، 100 زوج قاعدي، 1 كيلوبايت بلس، 50 زوج قاعدي) وعلامة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لها نهايات بارزة 5' يمكن وسمها باستخدام إنزيم T4 PNK (NEB# M0201) أو ملؤها باستخدام جزء كلينو (NEB# M0212). يمكن إجراء الوسم باستخدام PNK باتباع البروتوكول القياسي لإزالة مجموعات الفوسفات الموجودة من نهايات القطع باستخدام إنزيم CIP أو فوسفاتاز القطب الجنوبي، ولكننا حصلنا أيضًا على نتائج ممتازة باستخدام تفاعل "التبادل" الأبسط بكثير، والذي يستغل قدرة الكيناز على إزالة الفوسفات الموجودة من الحمض النووي واستبدالها بفوسفات موسوم. الإجراء الذي نجح معنا هو كالتالي: - 1 ميكرولتر من T4 PNK - 1 ميكرولتر من 32P ATP (3000 كوري/مليمول، 5 ملي كوري/مل) - 2 ميكرولتر من محلول منظم T4 PNK بتركيز 10x - 1 أو 2 ميكرولتر من سلم الحمض النووي (1 ميكروغرام). أضف الماء المقطر حتى يصل الحجم إلى 20 ميكرولتر. يُجرى التفاعل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. شغّل العينات لمدة 50 إلى 60 دقيقة عند جهد 100 فولت في محلول منظم TBE على هلام أكريلاميد بتركيز 4-20% (10 سم × 10 سم). يُعطي التعريض لمدة 20 دقيقة إشارات واضحة جدًا. تبلغ قوة الإشارة ضعف قوة الإشارة تقريبًا عند إضافة ADP بتركيز 100 ميكرومول. س: لماذا تظهر سلالم الحمض النووي في تحليل ساوثرن بلوت؟ ما هو تسلسل أو تركيب حزم السلم؟ ج: لوحظت هذه الظاهرة في العديد من المختبرات، ورغم عدم وجود تفسير قاطع لها، إلا أن هناك مصدرين محتملين لتهجين مسبار المستخدم مع الحمض النووي للسلم، والذي يبدو غير محتمل. أولهما، أنه إذا كان المسبار نفسه مُستخلصًا من بلازميد قائم على pUC أو pBR، فقد يكون هناك مستوى منخفض من تلوث البلازميد في المسبار الذي يتهجن مع نطاقات السلم، والتي تحتوي معظمها على تسلسلات شبيهة بـ pUC. ثانيهما، قد يكون هناك تشابه عشوائي منخفض التخصص بين المسبار وجزء من أجزاء السلم. تتكون النطاقات بالكامل من حمض نووي مُستخلص إما من pUC أو من الحمض النووي لفيروس غدي 2، والذي يُستخدم كحمض نووي حشو لإنتاج بلازميدات بالحجم المناسب للعلامات. ولأن الكمية المولية للحمض النووي في نطاقات السلم غالبًا ما تكون أعلى بكثير من الحمض النووي الذي يتم فحصه، فإن حتى التشابه المنخفض نسبيًا قد يؤدي إلى دمج كمية كافية من المسبار لإعطاء إشارة قابلة للكشف بسهولة. س: كيف يمكنني تحديد كمية الحمض النووي في كل حزمة من علامات الحمض النووي؟ ج: يمكن تحديد كمية الحمض النووي في كل حزمة بقسمة حجم الحزمة (بالأزواج القاعدية) على حجم جزيء الحمض النووي غير المقطوع (بالأزواج القاعدية)، ثم ضرب الناتج في إجمالي كمية علامات الحمض النووي المحملة على الهلام (بالميكروغرام). س: هل يمكنني استخدام صبغة ميدوري الخضراء مع سلالم الحمض النووي من شركة NEB؟ ج: سلالم الحمض النووي من NEB، بما في ذلك سلم الحمض النووي Quick-Load Purple 1 kb Plus (NEB #N0550)، متوافقة مع صبغة ميدوري الخضراء دون أي تداخل. يُرجى اتباع توصيات الشركة المصنعة للصبغة بدقة. نظرًا لانخفاض شدة الصبغة، قد تحتاج إلى تحميل ما بين 1 و2 ميكروغرام من سلم الحمض النووي للحصول على رؤية جيدة في ظل ظروف الإضاءة فوق البنفسجية القياسية. س: هل يمكنني استخدام صبغات SYBR® و/أو GelRed® مع سلالم الحمض النووي من NEB؟ ج: نظرًا لأن الأصباغ ذات الألفة العالية لربط الأحماض النووية قد تؤثر على هجرة الحمض النووي أثناء الفصل الكهربائي، يُنصح بشدة بتلوين الهلامات بعد الفصل الكهربائي باستخدام صبغات SYBR وGelRed. يُحسّن التلوين بعد الفصل الكهربائي الحساسية ويمنع تداخل الصبغة مع هجرة الحمض النووي. مع أن هلامات الأغاروز يمكن تحضيرها مسبقًا بهذه الأصباغ، إلا أن هجرة و/أو دقة بعض سلالم الحمض النووي قد تتأثر. لذلك، قد تتطلب بعض سلالم الحمض النووي تعديلًا/تخفيفًا عند تشغيلها على هلامات مُحضّرة مسبقًا بهذه الأصباغ. للحصول على أفضل النتائج، يُرجى اتباع توصيات وبروتوكولات الشركة المصنعة للصبغة بدقة، وخاصةً فيما يتعلق بكميات التحميل. نوصي باستخدام سلم الحمض النووي 1 كيلوبايت بلس للتلوين الآمن (NEB #N0559) عند استخدام SYBR أو GelRed كأصباغ مُحضّرة مسبقًا، حيث تم تحسين سلم الحمض النووي هذا خصيصًا لهذا التطبيق. بالإضافة إلى ذلك، تجنب استخدام أصباغ التحميل التي تحتوي على SDS، لأن SDS قد يُسبب نمطًا غير طبيعي للحزم في الهلامات المُحضّرة مسبقًا. نوصي باستخدام صبغة تحميل الجل، بنفسجي (6X)، بدون SDS (NEB #B7025) لهذا التطبيق. س: لماذا يطفو سلم الحمض النووي الخاص بي خارج الآبار؟ ولماذا لا تظهر أي حزم في مسار هلام سلم الحمض النووي؟ ج: إذا تم تجميد سلم الحمض النووي الجاهز للتحميل أو صبغة التحميل 6X المرفقة به في أي وقت، فسيشكل محلول الفيكول تدرجًا في الكثافة داخل القارورة عند إذابته. أي حجم يتم سحبه من أعلى القارورة سيحتوي على كمية صغيرة فقط من عامل الكثافة وسيطفو خارج الآبار. لمنع ذلك، اخلط جيدًا عند الاستلام وقبل الاستخدام. س: ما هي الاختلافات بين الإصدارات الأربعة من سلم الحمض النووي 1 كيلوبايت بلس (المعروف سابقًا باسم سلم الحمض النووي 2-لوغاريتم)، و100 زوج قاعدي، و1 كيلوبايت التي تبيعها شركة NEB؟ ج: تأتي هذه السلالم بأربعة أشكال. اختر من بين السلم التقليدي، أو إصدار Quick-Load® الذي يستخدم إما صبغة أرجوانية غير متألقة (NEB #B7024) أو أزرق بروموفينول كصبغة تثبيت، أو TriDye™ الذي يحتوي على ثلاث صبغات تعمل كـ وسائل بصرية لمراقبة تقدم عملية الهجرة أثناء الفصل الكهربائي على هلام الأغاروز. كما تتضمن النسخ سريعة التحميل قارورة من صبغة التحميل، مجانًا.