نيو إنجلاند بيولابس، N3234S، علامة تفاعل البوليميراز المتسلسل

الفئات ذات الصلة: علامات وسلالم الحمض النووي، التطبيقات، تحليل الحمض النووي، المواصفات، القواعد، كتلة القطعة (نانوغرام)، زوج قاعدي، 1، 62، 766، 2، 40، 500، 3، 48، 300، 4، 61، 150، 5، 89، 50، نطاق الحجم الفعال: من 50 إلى 766 زوج قاعدي، محلول التخزين: 10 ملي مولار Tris-HCl، 1 ملي مولار EDTA، درجة الحموضة 8 عند 25 درجة مئوية، الأسئلة الشائعة : س: ما هي النهايات البارزة على قطع سلم الحمض النووي؟ هل يمكنني وسمها باستخدام كيناز عديد النوكليوتيد T4 (PNK)؟ ماذا عن قطعة Klenow؟ أ: جميع القطع في سلالم الحمض النووي ذات الوزن الجزيئي المنخفض (1 كيلوبايت، 100 زوج قاعدي، 1 كيلوبايت بلس، 50 زوج قاعدي) وعلامة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لها نهايات بارزة 5' يمكن وسمها باستخدام إنزيم T4 PNK (NEB# M0201) أو ملؤها باستخدام جزء كلينو (NEB# M0212). يمكن إجراء الوسم باستخدام PNK باتباع البروتوكول القياسي لإزالة مجموعات الفوسفات الموجودة من نهايات القطع باستخدام إنزيم CIP أو فوسفاتاز القطب الجنوبي، ولكننا حصلنا أيضًا على نتائج ممتازة باستخدام تفاعل "التبادل" الأبسط بكثير، والذي يستغل قدرة الكيناز على إزالة الفوسفات الموجودة من الحمض النووي واستبدالها بفوسفات موسوم. الإجراء الذي أثبت فعاليته لدينا هو كالتالي: - 1 ميكرولتر من T4 PNK - 1 ميكرولتر من 32P ATP (3000 كوري/مليمول، 5 ملي كوري/مل) - 2 ميكرولتر من محلول منظم T4 PNK بتركيز 10x - 1 أو 2 ميكرولتر من سلم الحمض النووي (1 ميكروغرام). يُضاف الماء المقطر حتى يصل الحجم إلى 20 ميكرولتر. يُجرى التفاعل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تُشغل العينات لمدة 50 إلى 60 دقيقة عند جهد 100 فولت في محلول منظم TBE على هلام أكريلاميد بتركيز 4-20% (10 سم × 10 سم). يُعطي التعريض لمدة 20 دقيقة إشارات واضحة جدًا. تبلغ قوة الإشارة ضعف قوة الإشارة تقريبًا عند إضافة ADP بتركيز 100 ميكرومول. س: كيف يمكنني تحديد كمية الحمض النووي في كل حزمة من علامات الحمض النووي؟ ج: يمكن تحديد كمية الحمض النووي في كل حزمة بقسمة حجم الحزمة (بالأزواج القاعدية) على حجم جزيء الحمض النووي غير المقطوع (بالأزواج القاعدية)، ثم ضرب الناتج في إجمالي كمية الحمض النووي (بالميكروغرام) المحملة على الهلام. س: هل يمكنني استخدام صبغة ميدوري الخضراء مع سلالم الحمض النووي من شركة NEB؟ ج: سلالم الحمض النووي من NEB، بما في ذلك سلم الحمض النووي Quick-Load Purple 1 kb Plus (NEB #N0550)، متوافقة مع صبغة ميدوري الخضراء دون أي تداخل. يُرجى اتباع توصيات الشركة المصنعة للصبغة بدقة. نظرًا لانخفاض شدة الصبغة، قد تحتاج إلى تحميل ما بين 1 و2 ميكروغرام من سلم الحمض النووي للحصول على رؤية جيدة في ظل ظروف الإضاءة فوق البنفسجية القياسية. س: لماذا تظهر حزم إضافية على هلامات البولي أكريلاميد؟ ج: لزيادة شدة الحزم الأصغر حجمًا وحزم المرجع، تم استنساخ أجزاء متعددة من نفس الحجم في البلازميدات المستخدمة في العديد من سلالم الحمض النووي. هذه القطع، المتطابقة في الحجم، لا يمكن تمييزها على هلام الأغاروز، ولكن على هلام الأكريلاميد، حتى الاختلافات الطفيفة في تسلسل الحمض النووي قد تؤدي إلى معدلات هجرة مختلفة بشكل ملحوظ. لا تتحرك القطع ذات الحجم نفسه دائمًا بنفس الطريقة على الأكريلاميد. بالنسبة لسلم الحمض النووي ذي 100 زوج قاعدي، فإن القطعتين 500 و517 زوج قاعدي، اللتين تتحركان كشريط مزدوج متقارب على الأغاروز، تنفصلان بوضوح شديد على الأكريلاميد، حيث يقع الشريط 517 زوج قاعدي في منتصف المسافة تقريبًا بين القطعتين 500 و600 زوج قاعدي. تُعد هذه الهجرة "الشاذة" سمة متأصلة في الرحلان الكهربائي على هلام الأكريلاميد، ولا تشير إلى أي خطأ في الحجم المُحدد لقطع الحمض النووي في سلمنا. بالنسبة لسلم الحمض النووي ذي 50 زوجًا قاعديًا وسلم الوزن الجزيئي المنخفض، يميل اثنان أو أكثر من الحزم المكونة لحزمة المرجع ذات 200 زوج قاعدي إلى الظهور بشكل مختلف، مما ينتج عنه حزمة إضافية أو أكثر قابلة للكشف حول نطاق 200 زوج قاعدي. وكما هو الحال مع سلم الحمض النووي ذي 100 زوج قاعدي، يُعزى هذا الأمر بشكل أكبر إلى قيود تقنية هلام الأكريلاميد وليس إلى مشكلة في تركيب السلم. وكما هو موضح في معظم أدلة مختبرات البيولوجيا الجزيئية (دليل ماناتيس للاستنساخ الجزيئي في كولد سبرينغز هاربور، الطبعة الثانية) وكما أقرّ به مصنّعو هلام الأكريلاميد، ينبغي إجراء التطبيقات التي تتطلب تحديدًا دقيقًا لأحجام شظايا الحمض النووي باستخدام هلام الأغاروز كلما أمكن ذلك. س: هل يمكنني استخدام صبغات SYBR® و/أو GelRed® مع سلالم الحمض النووي من NEB؟ ج: نظرًا لأن صبغات ربط الأحماض النووية ذات الألفة العالية يمكن أن تؤثر على هجرة الحمض النووي أثناء الفصل الكهربائي، يُوصى بشدة بتلوين الهلامات بعد الفصل بصبغات SYBR وGelRed. يؤدي التلوين بعد الفصل الكهربائي إلى حساسية فائقة ويمنع تداخل الصبغة مع هجرة الحمض النووي. مع أن هلامات الأغاروز يمكن تحضيرها مسبقًا بهذه الصبغات، إلا أن هجرة و/أو فصل بعض سلالم الحمض النووي قد يتأثر. لذا، قد تتطلب بعض سلالم الحمض النووي تعديلًا/تخفيفًا عند تشغيلها على هلامات محضرة مسبقًا بهذه الصبغات. للحصول على أفضل النتائج، يُرجى اتباع توصيات وبروتوكولات الشركة المصنعة للصبغة بدقة، وخاصةً فيما يتعلق بكميات التحميل. نوصي باستخدام سلم الحمض النووي 1 كيلوبايت بلس للتلوين الآمن (NEB #N0559) عند استخدام SYBR أو GelRed كصبغات محضرة مسبقًا، حيث تم تحسين سلم الحمض النووي هذا خصيصًا لهذا التطبيق. بالإضافة إلى ذلك، تجنب استخدام صبغات التحميل التي تحتوي على SDS، لأن SDS قد يتسبب في ظهور نمط نطاقات غير طبيعي في الهلامات المحضرة مسبقًا. نوصي باستخدام صبغة تحميل الهلام، بنفسجي (6X)، بدون SDS (NEB #B7025) لهذا التطبيق. س: لماذا يطفو سلم الحمض النووي الخاص بي خارج الآبار؟ ولماذا لا تظهر أي حزم في مسار هلام سلم الحمض النووي؟ ج: إذا تم تجميد سلم الحمض النووي الجاهز للتحميل أو صبغة التحميل 6X المرفقة به في أي وقت، فسيتشكل تدرج كثافة في محلول الفيكول داخل القارورة عند إذابته. أي حجم يتم سحبه من أعلى القارورة سيحتوي على كمية صغيرة فقط من عامل الكثافة، وبالتالي سيطفو خارج الآبار. لمنع ذلك، يُرجى خلطه جيدًا عند الاستلام وقبل الاستخدام.