مختبرات نيو إنجلاند بيولابس، N3238S، سلم الحمض النووي السريع

الفئات ذات الصلة: علامات وسلالم الحمض النووي، التطبيقات، تحليل الحمض النووي، المواصفات، القواعد، كتلة القطعة (نانوغرام)، زوج قاعدي، 1، 36، 10002، 2، 36، 5001، 3، 36، 3001، 4، 38، 2000، 5، 28، 1500، 6، 108، 1000، 7، 43، 766، 8، 40، 500، 9، 33، 300، 10، 41، 150، 11، 61، 50، نطاق الحجم الفعال : من 50 إلى 10002 زوج قاعدي، محلول التخزين: 0.002% زيلين سيانول، 5 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 5 ملي مولار إيدتا، 5% جلسرين، درجة الحموضة 8 عند 25 درجة مئوية، الأسئلة الشائعة : س: ما كمية سلم الحمض النووي السريع التي يجب تحميلها على الهلام؟ ج: بالنسبة لنظام الفصل الكهربائي القياسي، نوصي بتحميل 0.5 ميكروغرام (20 ميكرولتر) من سلم الحمض النووي السريع على هلام الأغاروز. أما بالنسبة لنظام الفصل الكهربائي السريع (من 5 إلى 30 دقيقة فصل)، فاتبع توصيات الشركة المصنعة للنظام: من 5 إلى 20 ميكرولتر. قد يلزم تخفيف السلم. س: ما هي نسبة هلام الأغاروز التي يجب استخدامها؟ ج: أفضل فصل يكون على هلام أغاروز بتركيز 1.2% من محلول TAE، ولكن يمكنك أيضًا استخدام هلام TBE. عند تركيز أقل من 1%، قد لا ينفصل الجزء 50 زوجًا قاعديًا عن الجزء 150 زوجًا قاعديًا. س: هل يمكنني تخزينه عند -20 درجة مئوية؟ ج: للتخزين طويل الأمد، يمكنك التخزين عند 4 درجات مئوية أو -20 درجة مئوية. في حال التخزين عند -20 درجة مئوية، اخلط جيدًا بعد إذابة التجميد، حيث قد يشكل الصبغ ومحلول فيكول-400 تدرجًا في القارورة. س: لماذا تظهر حزم إضافية على هلامات البولي أكريلاميد؟ ج: لزيادة وضوح الحزم الأصغر حجمًا وحزم المرجع، تم استنساخ عدة أجزاء من نفس الحجم في البلازميدات المستخدمة في العديد من سلالم الحمض النووي. هذه الأجزاء، المتطابقة في الحجم، لا يمكن تمييزها على هلامات الأغاروز، ولكن على هلامات الأكريلاميد، حتى الاختلافات الطفيفة في تسلسل الحمض النووي يمكن أن تؤدي إلى معدلات هجرة مختلفة بشكل ملحوظ. لا تتحرك الأجزاء من نفس الحجم دائمًا بنفس الطريقة على الأكريلاميد. بالنسبة لسلم الحمض النووي 100 زوج قاعدي، فإن الجزأين 500 و517 زوج قاعدي، اللذين يتحركان كزوج متقارب على الأغاروز، ينفصلان بوضوح شديد على الأكريلاميد، حيث يقع الشريط 517 زوج قاعدي تقريبًا في منتصف المسافة بين الجزأين 500 و600 زوج قاعدي. هذه الهجرة "الشاذة" هي سمة متأصلة في الرحلان الكهربائي على هلام الأكريلاميد ولا تشير إلى أي خطأ في الحجم المحدد لأجزاء الحمض النووي في سلمنا. بالنسبة لسلم الحمض النووي ذي 50 زوجًا قاعديًا وسلم الوزن الجزيئي المنخفض، يميل اثنان أو أكثر من الحزم المكونة لحزمة المرجع ذات 200 زوج قاعدي إلى الظهور بشكل مختلف، مما ينتج عنه حزمة إضافية أو أكثر قابلة للكشف حول نطاق 200 زوج قاعدي. وكما هو الحال مع سلم الحمض النووي ذي 100 زوج قاعدي، يُعزى هذا الأمر بشكل أكبر إلى قيود تقنية هلام الأكريلاميد وليس إلى مشكلة في تركيب السلم. وكما هو مُعرّف في معظم أدلة مختبرات البيولوجيا الجزيئية (دليل ماناتيس للاستنساخ الجزيئي في كولد سبرينغز هاربور، الطبعة الثانية) وكما أقرّ به مصنّعو هلام الأكريلاميد، ينبغي إجراء التطبيقات التي تتطلب تحديدًا دقيقًا لأحجام شظايا الحمض النووي باستخدام هلام الأغاروز كلما أمكن ذلك. س: هل يعمل سلم الحمض النووي السريع مع نظام FlashGel® DNA أو نظام E-Gel® للرحلان الكهربائي على هلام الأغاروز المُسبق الصب؟ ج: تم اختبار سلم الحمض النووي السريع وهو مناسب لهلامات FlashGel® 1.2%، وهلامات E-Gel® 0.8%، و1.2%، و2% مع صبغة بروميد الإيثيديوم أو SYBR. كما أن سلم الحمض النووي هذا مناسب لهلامات E-Gel® EX 1% و2%، وهلامات E-Gel® NGS، وهلامات E-Gel® SizeSelect، وهلامات E-Gel® CloneWell، ولكن قد يتطلب تخفيفه من ½ إلى ¼ بالماء للحصول على أفضل النتائج. س: هل يمكنني استخدام صبغات SYBR® و/أو GelRed® مع سلالم الحمض النووي من NEB؟ ج: نظرًا لأن الصبغات ذات الألفة العالية لربط الأحماض النووية قد تؤثر على هجرة الحمض النووي أثناء الفصل الكهربائي، يُنصح بشدة بتلوين الهلامات بصبغات SYBR وGelRed بعد الفصل الكهربائي. يؤدي التلوين بعد الفصل الكهربائي إلى حساسية فائقة ويمنع تداخل الصبغة مع هجرة الحمض النووي. على الرغم من إمكانية تحضير هلامات الأغاروز مسبقًا بهذه الأصباغ، إلا أن ذلك قد يؤثر على هجرة و/أو فصل بعض سلالم الحمض النووي. لذا، قد تتطلب بعض سلالم الحمض النووي تعديلًا/تخفيفًا عند تشغيلها على هلامات مُحضّرة مسبقًا بهذه الأصباغ. وللحصول على أفضل النتائج، يُرجى اتباع توصيات وبروتوكولات الشركة المصنعة للأصباغ بدقة، وخاصةً فيما يتعلق بكميات التحميل. نوصي باستخدام سلم الحمض النووي 1 كيلوبايت بلس للتلوين الآمن (NEB #N0559) عند استخدام SYBR أو GelRed كأصباغ مُحضّرة مسبقًا، حيث تم تحسين سلم الحمض النووي هذا خصيصًا لهذا التطبيق. بالإضافة إلى ذلك، تجنب استخدام أصباغ التحميل التي تحتوي على SDS، لأن SDS قد يتسبب في ظهور نمط نطاقات غير طبيعي في الهلامات المُحضّرة مسبقًا. نوصي باستخدام صبغة تحميل الجل، بنفسجية (6X)، خالية من SDS (NEB #B7025) لهذا التطبيق. س: لماذا يطفو سلم الحمض النووي الخاص بي خارج الآبار؟ ولماذا لا تظهر أي حزم في مسار هلام سلم الحمض النووي؟ ج: إذا تم تجميد سلم الحمض النووي الجاهز للتحميل أو صبغة التحميل 6X المرفقة به في أي وقت، فسيتشكل تدرج كثافة في محلول الفيكول داخل القارورة عند إذابته. أي حجم يتم سحبه من أعلى القارورة سيحتوي على كمية صغيرة فقط من عامل الكثافة، وبالتالي سيطفو خارج الآبار. لمنع ذلك، يُرجى خلطه جيدًا عند الاستلام وقبل الاستخدام.