نيو إنجلاند بيولابس، N3271S، سلم الحمض النووي TriDye™ 100 bp

الفئات ذات الصلة: علامات وسلالم الحمض النووي، التطبيقات، تحليل الحمض النووي، المواصفات ، القواعد، كتلة القطعة (نانوغرام) زوج قاعدي، 1 45 1517، 2 35 1200، 3 95 1000، 4 27 900، 5 24 800، 6 21 700، 7 18 600، 8 97 500/517، 9 38 400، 10 29 300، 11 25 200، 12 48 100، نطاق الحجم الفعال: من 100 إلى 1517 زوج قاعدي ، محلول التخزين: 0.006% زيلين سيانول، 10 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 10 ملي مولار إيدتا، 10% جلسرين، 0.006% بروموفينول أزرق، 0.06% برتقالي G، الرقم الهيدروجيني 8 عند 25 درجة مئوية، الأسئلة الشائعة : س: لماذا تظهر سلالم الحمض النووي هل تظهر هذه الأشرطة في تحليل ساوثرن بلوت؟ ما هو تسلسل أو تركيب أشرطة السلم؟ ج: لوحظت هذه الظاهرة في العديد من المختبرات، ورغم عدم وجود تفسير قاطع، إلا أن هناك مصدرين محتملين لهذا التهجين غير المتوقع بين مسبار المستخدم وحمض DNA الخاص بالسلم. الأول هو أنه إذا كان المسبار نفسه مُستخلصًا من بلازميد قائم على pUC أو pBR، فقد يكون هناك مستوى منخفض من تلوث البلازميد في المسبار الذي يتهجن مع أشرطة السلم، والتي تحتوي معظمها على تسلسلات شبيهة بـ pUC. أما الثاني، فقد يكون مجرد تشابه عشوائي منخفض التخصص بين المسبار وجزء من أجزاء السلم. تتكون الأشرطة بالكامل من حمض DNA مُستخلص إما من pUC أو من حمض DNA الخاص بفيروس Adenovirus 2، والذي يُستخدم كحمض DNA إضافي لتوليد بلازميدات بالحجم المناسب للعلامات. نظرًا لأن كمية الحمض النووي في نطاقات السلم غالبًا ما تكون أعلى بكثير من كمية الحمض النووي المراد فحصه، فإن حتى التشابه المنخفض نسبيًا قد يؤدي إلى دمج كمية كافية من المجس لإعطاء إشارة قابلة للكشف بسهولة. س: كيف يمكنني تحديد كمية الحمض النووي في كل نطاق من نطاقات الواسم؟ ج: يمكن تحديد كمية الحمض النووي في كل نطاق بقسمة حجم النطاق (بالأزواج القاعدية) على حجم جزيء الحمض النووي غير المقطوع (بالأزواج القاعدية)، ثم ضرب الناتج في إجمالي كمية واسم الحمض النووي (بالميكروغرام) المحملة على الهلام. س: لماذا تظهر نطاقات إضافية على هلامات البولي أكريلاميد؟ ج: لزيادة شدة النطاقات الأصغر ونطاقات المرجع، تم استنساخ أجزاء متعددة من نفس الحجم في البلازميدات المستخدمة في العديد من سلالم الحمض النووي. هذه الأجزاء، المتطابقة في الحجم، لا يمكن تمييزها على هلامات الأغاروز، ولكن على هلامات الأكريلاميد، حتى الاختلافات الطفيفة في تسلسل الحمض النووي قد تؤدي إلى اختلافات ملحوظة في معدلات الهجرة. لا تتحرك القطع المتشابهة في الحجم دائمًا بنفس الطريقة على هلام الأكريلاميد. ففي سلم الحمض النووي ذي 100 زوج قاعدي، تنفصل القطعتان 500 و517 زوج قاعدي، اللتان تتحركان كشريطين متقاربين على هلام الأغاروز، بوضوح تام على هلام الأكريلاميد، حيث يقع الشريط 517 زوج قاعدي تقريبًا في منتصف المسافة بين القطعتين 500 و600 زوج قاعدي. تُعد هذه الهجرة "الشاذة" سمة متأصلة في الرحلان الكهربائي على هلام الأكريلاميد، ولا تشير إلى أي خطأ في الحجم المُحدد لقطع الحمض النووي في سلمنا. أما في سلم الحمض النووي ذي 50 زوج قاعدي وسلم الوزن الجزيئي المنخفض، فتميل شريطتان أو أكثر من الأشرطة المكونة للشريط المرجعي 200 زوج قاعدي إلى التحرك بشكل مختلف، مما ينتج عنه شريط إضافي واحد أو أكثر يمكن اكتشافه حول نطاق 200 زوج قاعدي. وكما هو الحال مع سلم الحمض النووي ذي 100 زوج قاعدي، يُعزى هذا الأمر بشكل أكبر إلى قيود تقنية هلام الأكريلاميد وليس إلى مشكلة في تركيب السلم. كما هو مُعرّف في معظم أدلة مختبرات البيولوجيا الجزيئية (دليل ماناتيس لاستنساخ الجزيئات في كولد سبرينغز هاربور، الطبعة الثانية) وكما أقرّ به مُصنّعو هلامات الأكريلاميد، يجب إجراء التطبيقات التي تتطلب تحديدًا دقيقًا لأحجام شظايا الحمض النووي باستخدام هلامات الأغاروز كلما أمكن ذلك. س: ما هي الاختلافات بين الإصدارات الأربعة من سلم الحمض النووي 1 كيلوبايت بلس (المعروف سابقًا باسم سلم الحمض النووي 2-لوغاريتم)، وسلالم الحمض النووي 100 زوج قاعدي، وسلالم الحمض النووي 1 كيلوبايت التي تبيعها شركة NEB؟ ج: تأتي هذه السلالم بأربعة أشكال. اختر من بين السلم التقليدي، أو إصدار التحميل السريع الذي يستخدم إما صبغة أرجوانية غير متألقة (NEB #B7024) أو أزرق بروموفينول كصبغة تثبيت، أو TriDye™ الذي يحتوي على ثلاث صبغات تُستخدم كأدوات بصرية لمراقبة تقدم الهجرة أثناء الفصل الكهربائي على هلام الأغاروز. تتضمن إصدارات التحميل السريع أيضًا قارورة من صبغة التحميل مجانًا. س: هل يُمكنني استخدام صبغة ميدوري الخضراء مع سلالم الحمض النووي من NEB؟ ج: تتوافق سلالم الحمض النووي من NEB، بما في ذلك سلم الحمض النووي Quick-Load Purple 1 kb Plus (NEB #N0550)، مع صبغة Midori Green دون أي تداخل ملحوظ. يُرجى اتباع توصيات الشركة المصنعة للصبغة بدقة. نظرًا لانخفاض شدة الصبغة، قد تحتاج إلى تحميل ما بين 1 و2 ميكروغرام من سلم الحمض النووي لتحقيق رؤية جيدة في ظل ظروف الإضاءة فوق البنفسجية القياسية. س: هل يُمكنني استخدام صبغات SYBR® و/أو GelRed® مع سلالم الحمض النووي من NEB؟ ج: نظرًا لأن الصبغات ذات الألفة العالية لربط الأحماض النووية يُمكن أن تؤثر على هجرة الحمض النووي أثناء الفصل الكهربائي، يُوصى بشدة بتلوين الهلامات بعد الفصل الكهربائي باستخدام صبغات SYBR وGelRed. يُؤدي التلوين بعد الفصل الكهربائي إلى حساسية فائقة ويُزيل احتمال تداخل الصبغة مع هجرة الحمض النووي. على الرغم من إمكانية صب هلامات الأغاروز مسبقًا بهذه الصبغات، إلا أن هجرة و/أو دقة بعض سلالم الحمض النووي قد تتأثر. لذا، قد تتطلب بعض سلالم الحمض النووي تعديلًا أو تخفيفًا عند تشغيلها على هلامات مُجهزة مسبقًا بهذه الأصباغ. وللحصول على أفضل النتائج، يُرجى اتباع توصيات الشركة المصنعة للأصباغ وبروتوكولاتها بدقة، لا سيما فيما يتعلق بكميات التحميل. نوصي باستخدام سلم الحمض النووي 1 كيلوبايت بلس للتلوين الآمن (NEB #N0559) عند استخدام SYBR أو GelRed كأصباغ مُجهزة مسبقًا، حيث تم تحسين سلم الحمض النووي هذا خصيصًا لهذا التطبيق. بالإضافة إلى ذلك، تجنب استخدام أصباغ التحميل التي تحتوي على SDS، لأن SDS قد يتسبب في ظهور نمط نطاقات غير طبيعي في الهلامات المُجهزة مسبقًا. نوصي باستخدام صبغة تحميل الهلام، بنفسجية (6X)، خالية من SDS (NEB #B7025) لهذا التطبيق. س: لماذا يطفو سلم الحمض النووي الخاص بي خارج الآبار؟ ولماذا لا تظهر أي حزم في مسار هلام سلم الحمض النووي؟ ج: إذا تم تجميد سلم الحمض النووي الجاهز للتحميل أو صبغة التحميل 6X المرفقة به في أي وقت، فسيتشكل تدرج كثافة في محلول الفيكول داخل القارورة عند إذابته. أي حجم يتم سحبه من أعلى القارورة سيحتوي على كمية صغيرة فقط من عامل الكثافة، وبالتالي سيطفو خارج الآبار. لمنع ذلك، يُرجى خلطه جيدًا عند الاستلام وقبل الاستخدام.