نيو إنجلاند بيولابس، N6707S، ناقل pTXB1

pTXB1 هو أحد الفئات ذات الصلة : نظام IMPACT، التعبير عن البروتين في بكتيريا الإشريكية القولونية، بلازميدات الحمض النووي والركائز، تطبيقات التعبير عن البروتين في الإشريكية القولونية، علامة تقارب التعبير عن البروتين، نطاق ربط الكيتين (CBD). الأسئلة الشائعة : س: ما هي النواقل المضمنة في مجموعة IMPACT؟ ج: تتضمن مجموعة IMPACT ثلاثة نواقل تعبير للإشريكية القولونية، مما يسمح بدمج علامة الإنتين القابلة للفصل إما في الطرف الكربوكسيلي (pTXB1) أو الطرف الأميني (pTYB11) للبروتين المستهدف. يعمل ناقل pMXB10 كعنصر تحكم إيجابي للتعبير والتنقية، ويمكن استخدامه أيضًا كناقل استنساخ. 1.9 ... يتم دمج البروتين المستهدف في نهايته C مع علامة إنتين ذاتية الانقسام (~28 كيلو دالتون) تحتوي على مجال ربط الكيتين (CBD، 6 كيلو دالتون) مما يسمح بتنقية السلائف المدمجة عن طريق التقارب على عمود الكيتين. يستخدم ناقل pTYB11 (#N6701S) إنتينًا من جين VMA1 الخاص بخميرة Saccharomyces cerevisiae (إنتين Sce VMA1؛ 454 حمضًا أمينيًا) (Chong, S. et al. (1998) استخدام نشاط الانقسام الطرفي C لعنصر ربط البروتين لتنقية البروتينات المؤتلفة في خطوة كروماتوغرافية واحدة. Nucl. Acids Res. 26, 5109–5115; Chong, S., et al. (1998) تعديل ربط البروتين لإنتين ATPase الغشائي الفجوي لخميرة Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 273, 10567–77). يتم دمج البروتين المستهدف في طرفه الأميني مع علامة VMA1 intein-CBD ذاتية الانقسام (56 كيلو دالتون). تتيح هذه العلامة تنقية البروتين الأولي المدمج باستخدام عمود الكيتين. صُمم الناقل لتنقية البروتين المستهدف دون أي أحماض أمينية إضافية، أو دون بقايا ميثيونين في الطرف الأميني، وذلك عن طريق استنساخ طرفه 5' في موقع SapI. يحمل ناقل التحكم، pMXB10 (#N6903S)، المشتق من pTXB1، البروتين المستهدف، وهو بروتين ربط المالتوز (MBP)، مُدرجًا مسبقًا في اتجاه 5' من نطاق ربط الكانابينويد (CBD) الخاص بـ Mxe GyrA. يؤدي التحفيز إلى إنتاج بروتين MBP-GyrA المدمج، والذي عند فصله، ينتج عنه فصل MBP. يمكن استخدام مناطق الربط المتعددة المحيطة بالمنطقة المشفرة لـ MBP بسهولة لاستنساخ جين مُحدد. مع ذلك، بعد فصل الإنتين، سيحتوي البروتين المستهدف على أحماض أمينية إضافية في طرفه الكربوكسيلي، بما في ذلك (LEY)، الذي يتميز بنسبة فصل ناجحة عالية. تستخدم نواقل IMPACT مُحفِّز T7 لتوفير تحكم دقيق في التعبير عن جين الاندماج في بكتيريا الإشريكية القولونية (Dubendorff, JW and Studier, FW (1991) Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor. J. Mol. Biol. 219, 45–59). تحمل نواقل IMPACT علامة جين Ampr (جين bla)، الذي يُكسب السلالة المضيفة مقاومة للأمبيسيلين؛ أحد النواقل، pKYB1 (#N6706S)، مقاوم للكاناميسين (متوفر بشكل منفصل). س: ما هو تسلسل الحمض النووي لهذا المنتج؟ ج: يمكن العثور على تسلسل الحمض النووي في أداة تسلسلات وخرائط الحمض النووي.