مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، P0702L، إندو H

إنزيم إندوغليكوزيداز H هو إنزيم غليكوزيداز مُعاد التركيب يقوم بفصل جزيئات الكيتوبيوز الموجودة في المانوز العالي وبعض السكريات قليلة الوحدات الهجينة من البروتينات السكرية المرتبطة بالنيتروجين. يتوفر أيضًا إصدار مُوسَم، وهو عبارة عن بروتين مُعاد التركيب مُدمج من إندوغليكوزيداز H وبروتين ربط المالتوز. التصنيفات ذات الصلة: إنزيمات إندوغليكوزيداز، تطبيقات تحليل البروتينات، أنظمة التعبير، تسلسل الغليكان، علم البروتينات. تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لإزالة أكثر من 95% من الكربوهيدرات من 10 ميكروغرام من إنزيم RNase B المُشوه في ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر (10 وحدات NEB = 1 وحدة دولية IUB). طريقة تعريف الوحدة: يتم تسخين 10 ميكروغرام من إنزيم RNase B باستخدام محلول تسخين البروتينات السكرية بتركيز 1X عند درجة حرارة 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد إضافة محلول التسخين السكري 3 بتركيز 1X، تُضاف تخفيفات متسلسلة من إنزيم Endo H، ويُحضن مزيج التفاعل لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. يتم تصوير فصل نواتج التفاعل باستخدام تقنية SDS-PAGE. محلول مُزيل لتكوين البروتينات السكرية 1X، 0.5% SDS، 40 ملي مولار DTT. شروط التفاعل: محلول غليكوبافر 3 1X، حضانة عند 37 درجة مئوية. محلول غليكوبافر 3 1X، 50 ملي مولار أسيتات الصوديوم (الأس الهيدروجيني 6 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين : 20 ملي مولار Tris-HCl، 50 ملي مولار NaCl، 5 ملي مولار EDTA، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري : 75 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الوزن الجزيئي الظاهري : 29 كيلو دالتون. الأسئلة الشائعة : س: ما الفرق بين PNGase F و Endo H و O-Glycosidase؟ ج: يزيل PNGase F جميع أنواع الغلكزة المرتبطة بالنيتروجين (المرتبطة بالأسباراجين)؛ عالية المانوز، والهجينة، وثنائية، وثلاثية، ورباعية التفرع. ستختار هذا الإنزيم إذا كان هدفك هو إزالة جميع الكربوهيدرات المرتبطة بالنيتروجين بغض النظر عن نوعها. يزيل إنزيم Endo H فقط سكريات المانوز العالية وبعض أنواع الكربوهيدرات المرتبطة بالنيتروجين. يُنصح باختيار هذا الإنزيم لتحديد نوع الارتباط بالنيتروجين بدقة أكبر، أو إذا كان البروتين يحتوي على كربوهيدرات حساسة لإنزيم Endo H. أما إنزيم O-Glycosidase من شركة NEB فيزيل ثنائيات السكاريد المرتبطة بالنيتروجين من النوعين 1 و3 منزوعة حمض السياليك والمرتبطة ببقايا سيرين/ثريونين. س: ما الفرق بين إنزيم Endo H وإنزيم Endo Hf؟ ج: إنزيم Endo H وإنزيم Endo Hf هما نفس الإنزيم، ولكن إنزيم Endo Hf هو بروتين اندماجي من إنزيم Endo H وبروتين ربط المانوز (MBP). تم هندسة هذا البروتين مع إضافة بروتين ربط المانوز (MBP) لتسهيل تنقية الإنزيم. يتمتع البروتين الاندماجي بنفس نشاط البروتين غير الاندماجي. لا يوجد فرق في النشاط بين إنزيم Endo H وإنزيم Endo Hf على البروتين السكري. س: جربت إنزيم Endo H/Hf على البروتين السكري الخاص بي، ولكنه لم ينجح. ما المشكلة المحتملة؟ ج: أولًا، هل تعرف كيف يرتبط الكربوهيدرات بالبروتين؟ هل هو مرتبط برابطة N أم O (مرتبط بحمض الأسبارتيك أو السيرين/الثريونين)؟ ثانيًا، هل ركيزة الكربوهيدرات من نوع المانوز العالي؟ إذا كنت غير متأكد، فقد يكون إنزيم إندوغليكوزيداز أكثر عمومية، مثل PNGase F، هو الأنسب. إذا كنت متأكدًا من وجود كربوهيدرات من نوع المانوز العالي المرتبطة برابطة N، فتأكد من فصل البروتين قبل إزالة الغليكوزيل. غالبًا ما يمنع التركيب الثانوي والثالثي للبروتينات إنزيمات الإندوغليكوزيداز من الوصول إلى ركيزتها، مما يجعل فصل البروتين خطوة حاسمة في عملية الفصل الفعالة. إذا كنت لا ترغب في فصل البروتين، ففكر في إضافة المزيد من الإنزيم وفترة حضانة أطول. تذكر أن إنزيم Endo H/Hf يزيل تحديدًا المانوز العالي وبعض الكربوهيدرات "الهجينة" من البروتينات السكرية. إذا كان الكربوهيدرات أكثر تعقيدًا، فلن يقوم إنزيم Endo H بفصله. يُعدّ إنزيم PNGase F مفيدًا في إزالة جميع أنواع الكربوهيدرات المرتبطة بالنيتروجين من البروتينات السكرية. س: ما هي كمية إنزيم Endo H/Endo Hf التي يجب استخدامها؟ ج: يكفي 1-2 ميكرولتر من إنزيم Endo H/Hf لإزالة السكريات من 5-20 ميكروغرام من البروتين السكري المُتَمَسِّخ في ساعة واحدة. س: هل يُثبِّط SDS إنزيم Endo H/Endo Hf؟ ج: لا. س: ما هي ظروف التفاعل النموذجية لإنزيم Endo H؟ ج: ظروف التفاعل النموذجية هي كما يلي: 1. امزج 1-20 ميكروغرام من البروتين السكري، و1 ميكرولتر من محلول مُعَسِّخ البروتين السكري بتركيز 10X، والماء (إذا لزم الأمر) للحصول على حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر. 2. قم بتَمَسُّخ البروتين السكري بتسخين التفاعل عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. 3. حضّر حجم تفاعل إجمالي قدره 20 ميكرولتر بإضافة 2 ميكرولتر من محلول غليكو 3 بتركيز 10X، وماء، و1-5 ميكرولتر من إنزيم إندو H. 4. حضّن التفاعل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ملاحظة: يمكن زيادة حجم التفاعلات خطيًا لاستيعاب أحجام تفاعل أكبر. س: هل مثبطات البروتياز مقبولة للاستخدام في تفاعل إندو H/Hf؟ ج: أبروتينين (تركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل) بنزاميدين (تركيز نهائي 1 ملي مولار) بيبستاتين (تركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل) ليوبيبتين (تركيز نهائي 1 ميكرومولار) إي جي تي إيه (تركيز نهائي 1 ملي مولار) إي دي تي إيه (تركيز نهائي 1 ملي مولار) بي إم إس إف (تركيز نهائي 1 ملي مولار) حضّر محلولًا مركزًا 1000X من كل مثبط في الماء؛ باستثناء البيبستاتين الذي يجب إذابته في الميثانول. ملاحظة: يتمتع PMSF بالقدرة على تعديل البقايا القاعدية على ركائز البروتينات السكرية. س: ما هي الجليكوسيدازات وما استخداماتها؟ ج: تُستخدم الجليكوسيدازات للحصول على معلومات حول مجموعات الكربوهيدرات المرتبطة بالبروتينات السكرية والببتيدات السكرية. وهي نوعان: إندوجليكوسيدازات التي تفصل مجموعات الكربوهيدرات بالكامل عن البروتينات، وإكسوجليكوسيدازات التي تزيل السكريات الأحادية من النهايات غير المختزلة للكربوهيدرات. النهاية المختزلة هي تلك التي يُنتجها إندوجليكوسيداز. غالبًا ما يستخدم الباحثون إندوجليكوسيداز متبوعًا بواحد أو أكثر من الإكسوجليكوسيدازات، ثم يحللون النواتج باستخدام SDS-PAGE أو أنواع مختلفة من الكروماتوغرافيا السائلة. س: لماذا غيّرت إنزيمات NEB Glycosidase محاليل التفاعل؟ ما هي محاليل التفاعل الجديدة، وهل لا يزال بإمكاني استخدام الإنزيم مع محلوله القديم؟ أين يمكنني العثور على تركيبة المحاليل القديمة؟ ج: لتبسيط سير العمل وعمليات الهضم باستخدام اثنين أو أكثر من الإكسوغليكوزيدازات، تُزوَّد معظم الإنزيمات الآن بمحلول غليكوبفر 1 بتركيز 10X. ويُستثنى من ذلك إنزيمان يُزوَّدان بمحلول غليكوبفر 4. كما تم تبسيط مجموعة المحاليل المنظمة للإندوغليكوزيدازات. وقد تم تقييم نشاط كل إنزيم من الإندوغليكوزيدازات والإكسوغليكوزيدازات في كلٍّ من نظام المحلول المنظم القديم والجديد. احتفظت جميع الإنزيمات إما بنفس النشاط، أو وُجد أن نشاطها أكبر في المحلول المنظم الجديد. لا تزال بعض الإكسوغليكوزيدازات تُزوَّد بقارورة إضافية من rHSA (يعزز rHSA نشاط بعض الإنزيمات). وكما كان الحال سابقًا، لا تزال بعض الإكسوغليكوزيدازات تُزوَّد بقارورة إضافية من BSA (يعزز BSA نشاط بعض الإنزيمات). ولا تزال المكونات الأخرى (مثل محلول تمسخ البروتين السكري، وNP-40، وما إلى ذلك) متوفرة عند الحاجة. رقم منتج الإنزيم، المحلول المنظم القديم، المحلول المنظم الحالي، هل تم التغيير؟ إنزيم ألفا-إن-أسيتيل جالاكتوزامينيداز P0734 G7 جليكوبافر 1 نعم، إنزيم ألفا1-2 فوكوسيداز P0724 G4 جليكوبافر 1 نعم، إنزيم ألفا1-2،3،4،6 فوكوسيداز P0748 --- جليكوبافر 1 --- إنزيم ألفا1-2،4،6 فوكوسيداز O p0749 --- جليكوبافر 1 --- إنزيم ألفا1-3،4 فوكوسيداز p0769 --- جليكوبافر 1 --- إنزيم ألفا1-2،3 مانوسيداز P0729 G6 جليكوبافر 1 لا، إنزيم ألفا1-6 مانوسيداز P0727 G2 جليكوبافر 1 نعم، إنزيم ألفا1-2،3،6 مانوسيداز p0768 --- جليكوبافر 4 --- غالاكتوزيداز α1-3,4,6 P0747 --- غليكوبافر 1 ---- غالاكتوزيداز α1-3,6 P0731 G6 غليكوبافر 1 لا نيورامينيداز α2-3 S P0743 --- غليكوبافر 1 --- نيورامينيداز α2-3,6,8 P0720 G1 غليكوبافر 1 نعم نيورامينيداز α2-3,6,8,9 A P0722 --- غليكوبافر 1 --- β-N-أسيتيل هيكسوزامينيداز P0721 G2 غليكوبافر 1 نعم β-N-أسيتيل غلوكوزامينيداز P0732 G1 غليكوبافر 1 نعم β-N-أسيتيل غلوكوزامينيداز S P0744 --- غليكوبافر 1 --- β1-3 جالاكتوزيداز P0726 G6 GlycoBuffer 1 لا β1-4 جالاكتوزيداز S P0745 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3,4 جالاكتوزيداز p0746 --- GlycoBuffer 4 --- N-Glycan Sequencing Kit E0577 --- GlycoBuffer 1 --- Endo S P0741 G6 GlycoBuffer 1 نعم Endo H P0702 G5 GlycoBuffer 3 نعم Endo Hf P0703 G5 GlycoBuffer 3 نعم Endo F2 p0772 --- GlycoBuffer 4 --- Endo F3 p0771 --- GlycoBuffer 4 --- Endo D P0742 G7 GlycoBuffer 2 لا O-Glycosidase P0733 G7 مجموعة GlycoBuffer 2 بدون O-Glycosidase و Neuraminidase E0540 G7 GlycoBuffer 2 بدون Remove-iT® PNGase F P0706 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F P0704 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F (خالي من الجلسرين) P0705 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F، مُعاد التركيب P0708 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F (خالي من الجلسرين)، مُعاد التركيب P0709 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase A p0707 --- Glyco Buffer 3 --- مزيج إزالة الغليكوزيل من البروتين II p6044 --- مزيج إزالة الغليكوزيل Buffer 1 و 2 --- Rapid PNGase F P0710 --- Rapid PNGase F Buffer ---- Rapid™ PNGase F (صيغة غير مُختزلة) p0711 --- محلول منظم سريع لإنزيم PNGase F (صيغة غير مختزلة) س: ما هو الركيزة المناسبة لإنزيم الإندوغليكوزيداز؟ ج: بالنسبة لإنزيم PNGaseF ومزيج إزالة الغليكوزيل من البروتين، نقترح استخدام فيتوين (NEB #P6042، المرفق مع مزيج إزالة الغليكوزيل من البروتين). بالنسبة لإنزيم PNGaseF، وإنزيم Endo H، وإنزيم Endo Hf، نقترح استخدام RNase B (NEB #P7817). بالنسبة لإنزيم Endo D، نقترح استخدام فوسفوليباز A من سم النحل. بالنسبة لإنزيم Endo S، نقترح استخدام IgG أحادي النسيلة من الفأر (NEB #E8032). بالنسبة لإنزيم O-غليكوزيداز، نقترح استخدام p-نيتروفينيل غالاكتو-N-بيوسيد (Galβ1-3GalNAcα1pNP، أو Core1-pNP). بدلاً من ذلك، يمكن هضم فيتوين باستخدام نيورامينيداز، أو نيورامينيداز مع إنزيم O-غليكوزيداز. يمكن ملاحظة التغيرات في الوزن الجزيئي بعد إزالة السكريات باستخدام تقنية SDS-PAGE. س: هل تُثبِّط المنظفات إنزيمات الإكسوغليكوزيداز/الإندوغليكوزيداز؟ ج: عند مستويات معتدلة (0.5-1.0% من المنظفات الأيونية وغير الأيونية)، تُظهر معظم إنزيمات الغليكوزيداز نشاطًا مُرضيًا أو لا تتأثر. الاستثناءات هي: إنزيم PNGase F (جميع التركيبات)، وإنزيم O-غليكوزيداز، وإنزيم β-N-أسيتيل غلوكوزامينيداز، والتي تُثبَّط بواسطة SDS. من الضروري إضافة NP-40 بتركيز نهائي 1% إلى مزيج التفاعل لمواجهة تثبيط المنظفات. يُثبَّط إنزيم Endo D أيضًا بواسطة SDS، ولكن NP-40 لا يُعاكس هذا التثبيط. وأخيرًا، يمكن أن تمنع عوامل التثبيت الشائعة مثل Tween و Triton X-100 و NP-40 و octyl glucoside و sulfobetaines غير المنظفة، بالإضافة إلى آثار المذيبات العضوية، عملية إزالة الغليكوزيل السريعة المثلى بواسطة Rapid PNGase F.