مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، P0703L، إندو إتش إف

إن إندو إتش إف هو بروتين مُعاد التركيب مُدمج من إندوغليكوزيداز إتش وبروتين ربط المالتوز. يقوم إندو إتش إف بفصل الكيتوبيوز الموجود في لب المانوز العالي وبعض السكريات قليلة الوحدات الهجينة من البروتينات السكرية المرتبطة بالنيتروجين بنفس كفاءة إندو إتش. الفئات ذات الصلة : إندوغليكوزيداز، تطبيقات تحليل البروتينات، أنظمة التعبير، تسلسل الغليكان، علم البروتينات، تعريف وحدة المواصفات : تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لإزالة أكثر من 95% من الكربوهيدرات من 10 ميكروغرام من إنزيم RNase B المُشوَّه في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر (10 وحدات NEB = 1 وحدة IUB ملي). طريقة تعريف الوحدة: يتم تسخين 10 ميكروغرام من إنزيم RNase B باستخدام محلول تسخين البروتينات السكرية 1X (0.5% SDS، 40 ملي مولار DTT) عند درجة حرارة 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد إضافة محلول التسخين 1X GlycoBuffer 3، تُضاف تخفيفات متسلسلة من إنزيم Endo H f، ويُحضن مزيج التفاعل لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. يتم تصوير نواتج التفاعل باستخدام تقنية SDS-PAGE. محلول مُزيل لطبيعة البروتين السكري 1X، 0.5% SDS، 40 ملي مولار DTT. شروط التفاعل: محلول غليكوبافر 3 1X، حضانة عند 37 درجة مئوية. محلول غليكوبافر 3 1X، 50 ملي مولار أسيتات الصوديوم (الأس الهيدروجيني 6 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 20 ملي مولار Tris-HCl، 50 ملي مولار NaCl، 5 ملي مولار EDTA، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري : 75 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الوزن الجزيئي الظاهري : 70 كيلو دالتون. الأسئلة الشائعة : س: ما الفرق بين PNGase F و Endo H؟ ج: يزيل PNGase F جميع أنواع الغلكزة المرتبطة بالنيتروجين (المرتبطة بالأسباراجين) تقريبًا: المانوز العالي، والهجين، وثنائي وثلاثي ورباعي التفرع. ستختار هذا الإنزيم إذا كان هدفك هو إزالة جميع الكربوهيدرات المرتبطة بالنيتروجين بغض النظر عن نوعها. يزيل إنزيم Endo H فقط سكريات المانوز العالية وبعض أنواع الكربوهيدرات الهجينة المرتبطة بالنيتروجين. يُختار هذا الإنزيم لتحديد نوع الارتباط بالنيتروجين بدقة أكبر، أو إذا كان البروتين يحتوي على كربوهيدرات حساسة لإنزيم Endo H. س: ما الفرق بين إنزيم Endo H وإنزيم Endo Hf؟ ج: إنزيم Endo H وإنزيم Endo Hf هما نفس الإنزيم، لكن إنزيم Endo Hf هو بروتين اندماجي من إنزيم Endo H وبروتين ربط المانوز (MBP). تم هندسة هذا البروتين مع إضافة بروتين ربط المانوز للمساعدة في تنقية الإنزيم. يتمتع البروتين الاندماجي بنفس نشاط البروتين غير الاندماجي. لا يوجد فرق في النشاط بين إنزيم Endo H وإنزيم Endo Hf على البروتين السكري. س: جربت إنزيم Endo H/Hf على البروتين السكري الخاص بي ولم ينجح. ما المشكلة؟ ج: أولًا، هل تعرف كيف يرتبط الكربوهيدرات بالبروتين؟ هل هو مرتبط بالنيتروجين أم بالأكسجين (مرتبط بحمض الأسبارتيك أو السيرين/الثريونين)؟ ثانيًا، هل الركيزة الكربوهيدراتية من نوع المانوز العالي؟ إذا كنت غير متأكد، فقد يكون إنزيم إندوغليكوزيداز الأكثر عمومية، PNGase F، هو الأنسب. إذا كنت متأكدًا من وجود كربوهيدرات مرتبطة بالنيتروجين من نوع المانوز العالي، فتأكد من فصل البروتين قبل إزالة الغليكوزيل. غالبًا ما تمنع البنية الثانوية والثالثية للبروتينات إنزيمات الإندوغليكوزيداز من الوصول إلى ركائزها، مما يجعل فصل البروتين خطوة حاسمة في عملية الفصل الفعالة. إذا كنت لا ترغب في فصل البروتين، ففكر في إضافة المزيد من الإنزيم وفترة حضانة أطول. تذكر أن إنزيم Endo H/Hf يزيل تحديدًا المانوز العالي وبعض الكربوهيدرات "الهجينة" من البروتينات السكرية. إذا كانت الكربوهيدرات أكثر تعقيدًا، فلن يقوم إنزيم Endo H بفصلها. يُعد إنزيم PNGase F مفيدًا في إزالة جميع أنواع الكربوهيدرات المرتبطة بالنيتروجين من البروتينات السكرية. س: ما هي كمية إنزيم Endo H/Endo Hf التي يجب استخدامها؟ ج: يكفي 1-2 ميكرولتر من إنزيم Endo H/Hf لإزالة الغليكوزيل من 5-20 ميكروغرام من البروتين السكري المتغير طبيعته خلال ساعة واحدة. س: هل يُثبط إنزيم Endo H/Endo Hf بواسطة SDS؟ ج: لا. س: ما هي ظروف التفاعل النموذجية لإنزيم Endo Hf؟ ج: ظروف التفاعل النموذجية هي كالتالي: 1. امزج 1-20 ميكروغرام من البروتين السكري، و1 ميكرولتر من محلول إزالة طبيعة البروتين السكري بتركيز 10X، والماء (إذا لزم الأمر) لتكوين حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر. 2. قم بفصل طبيعة البروتين السكري عن طريق تسخين التفاعل عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. 3. حضّر حجم تفاعل إجمالي قدره 20 ميكرولتر بإضافة 2 ميكرولتر من محلول غليكو 3 بتركيز 10X، وماء، و1-5 ميكرولتر من إنزيم إندو H. 4. حضّن التفاعل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ملاحظة: يمكن زيادة حجم التفاعلات خطيًا لاستيعاب أحجام تفاعل أكبر. س: هل مثبطات البروتياز مقبولة للاستخدام في تفاعل إندو H/Hf؟ ج: أبروتينين (تركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل) بنزاميدين (تركيز نهائي 1 ملي مولار) بيبستاتين (تركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل) ليوبيبتين (تركيز نهائي 1 ميكرومولار) إي جي تي إيه (تركيز نهائي 1 ملي مولار) إي دي تي إيه (تركيز نهائي 1 ملي مولار) بي إم إس إف (تركيز نهائي 1 ملي مولار) حضّر محلولًا مركزًا 1000X من كل مثبط في الماء؛ باستثناء البيبستاتين الذي يجب إذابته في الميثانول. ملاحظة: يتمتع PMSF بالقدرة على تعديل البقايا القاعدية على ركائز البروتينات السكرية. س: لماذا غيّرت إنزيمات NEB Glycosidase محاليل التفاعل؟ ما هي محاليل التفاعل الجديدة، وهل لا يزال بإمكاني استخدام الإنزيم مع محلوله القديم؟ أين يمكنني العثور على تركيبة المحاليل القديمة؟ ج: لتبسيط سير العمل وعمليات الهضم باستخدام اثنين أو أكثر من الإكسوغليكوزيداز، يتم الآن تزويد معظم الإنزيمات بمحلول GlycoBuffer 1 بتركيز 10X. ويُستثنى من ذلك إنزيمان مزودان بمحلول GlycoBuffer 4. كما تم تبسيط مجموعة محاليل الإندوغليكوزيداز. تم تقييم نشاط كل إنزيم إندوغليكوزيداز وإكسوغليكوزيداز في كل من نظام المحلول القديم والجديد. احتفظت جميع الإنزيمات إما بنفس النشاط، أو وُجد أن نشاطها أكبر في المحلول الجديد. لا تزال بعض الإكسوغليكوزيدازات تُزوَّد بقارورة إضافية من rHSA (يعزز rHSA نشاط بعض الإنزيمات). وكما في السابق، لا تزال بعض الإكسوغليكوزيدازات تُزوَّد بقارورة إضافية من BSA (يعزز BSA نشاط بعض الإنزيمات). ولا تزال المكونات الأخرى (مثل محلول تسييل البروتينات السكرية، وNP-40، إلخ) تُزوَّد عند الحاجة. رقم منتج الإنزيم، المحلول القديم، المحلول الحالي، هل تم تغييره؟ إنزيم ألفا-إن-أسيتيل جالاكتوزامينيداز P0734 G7 جليكوبافر 1 نعم، إنزيم ألفا1-2 فوكوسيداز P0724 G4 جليكوبافر 1 نعم، إنزيم ألفا1-2،3،4،6 فوكوسيداز P0748 --- جليكوبافر 1 --- إنزيم ألفا1-2،4،6 فوكوسيداز O p0749 --- جليكوبافر 1 --- إنزيم ألفا1-3،4 فوكوسيداز p0769 --- جليكوبافر 1 --- إنزيم ألفا1-2،3 مانوسيداز P0729 G6 جليكوبافر 1 لا، إنزيم ألفا1-6 مانوسيداز P0727 G2 جليكوبافر 1 نعم، إنزيم ألفا1-2،3،6 مانوسيداز p0768 --- جليكوبافر 4 --- غالاكتوزيداز α1-3,4,6 P0747 --- غليكوبافر 1 ---- غالاكتوزيداز α1-3,6 P0731 G6 غليكوبافر 1 لا نيورامينيداز α2-3 S P0743 --- غليكوبافر 1 --- نيورامينيداز α2-3,6,8 P0720 G1 غليكوبافر 1 نعم نيورامينيداز α2-3,6,8,9 A P0722 --- غليكوبافر 1 --- β-N-أسيتيل هيكسوزامينيداز P0721 G2 غليكوبافر 1 نعم β-N-أسيتيل غلوكوزامينيداز P0732 G1 غليكوبافر 1 نعم β-N-أسيتيل غلوكوزامينيداز S P0744 --- غليكوبافر 1 --- β1-3 جالاكتوزيداز P0726 G6 GlycoBuffer 1 لا β1-4 جالاكتوزيداز S P0745 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3,4 جالاكتوزيداز p0746 --- GlycoBuffer 4 --- N-Glycan Sequencing Kit E0577 --- GlycoBuffer 1 --- Endo S P0741 G6 GlycoBuffer 1 نعم Endo H P0702 G5 GlycoBuffer 3 نعم Endo Hf P0703 G5 GlycoBuffer 3 نعم Endo F2 p0772 --- GlycoBuffer 4 --- Endo F3 p0771 --- GlycoBuffer 4 --- Endo D P0742 G7 GlycoBuffer 2 لا O-Glycosidase P0733 G7 مجموعة GlycoBuffer 2 بدون O-Glycosidase و Neuraminidase E0540 G7 GlycoBuffer 2 بدون Remove-iT® PNGase F P0706 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F P0704 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F (خالي من الجلسرين) P0705 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F، مُعاد التركيب P0708 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F (خالي من الجلسرين)، مُعاد التركيب P0709 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase A p0707 --- Glyco Buffer 3 --- مزيج إزالة الغليكوزيل من البروتين II p6044 --- مزيج إزالة الغليكوزيل Buffer 1 و 2 --- Rapid PNGase F P0710 --- Rapid PNGase F Buffer ---- Rapid™ PNGase F (صيغة غير مُختزلة) p0711 --- محلول منظم سريع لإنزيم PNGase F (صيغة غير مختزلة) س: ما هو الركيزة المناسبة لإنزيم الإندوغليكوزيداز؟ ج: بالنسبة لإنزيم PNGaseF ومزيج إزالة الغليكوزيل من البروتين، نقترح استخدام فيتوين (NEB #P6042، المرفق مع مزيج إزالة الغليكوزيل من البروتين). بالنسبة لإنزيم PNGaseF، وإنزيم Endo H، وإنزيم Endo Hf، نقترح استخدام RNase B (NEB #P7817). بالنسبة لإنزيم Endo D، نقترح استخدام فوسفوليباز A من سم النحل. بالنسبة لإنزيم Endo S، نقترح استخدام IgG أحادي النسيلة من الفأر (NEB #E8032). بالنسبة لإنزيم O-غليكوزيداز، نقترح استخدام p-نيتروفينيل غالاكتو-N-بيوسيد (Galβ1-3GalNAcα1pNP، أو Core1-pNP). بدلاً من ذلك، يمكن هضم فيتوين باستخدام نيورامينيداز، أو نيورامينيداز مع إنزيم O-غليكوزيداز. يمكن ملاحظة التغيرات في الوزن الجزيئي بعد إزالة السكريات باستخدام تقنية SDS-PAGE. س: هل تُثبِّط المنظفات إنزيمات الإكسوغليكوزيداز/الإندوغليكوزيداز؟ ج: عند مستويات معتدلة (0.5-1.0% من المنظفات الأيونية وغير الأيونية)، تُظهر معظم إنزيمات الغليكوزيداز نشاطًا مُرضيًا أو لا تتأثر. الاستثناءات هي: إنزيم PNGase F (جميع التركيبات)، وإنزيم O-غليكوزيداز، وإنزيم β-N-أسيتيل غلوكوزامينيداز، والتي تُثبَّط بواسطة SDS. من الضروري إضافة NP-40 بتركيز نهائي 1% إلى مزيج التفاعل لمواجهة تثبيط المنظفات. يُثبَّط إنزيم Endo D أيضًا بواسطة SDS، ولكن NP-40 لا يُعاكس هذا التثبيط. أخيرًا، يمكن للمواد المُثبِّتة الشائعة، مثل توين، وتريتون X-100، وNP-40، وأوكتيل جلوكوزيد، وسلفوبيتينات غير مُنظِّفة، بالإضافة إلى آثار المذيبات العضوية، أن تمنع عملية إزالة الغليكوزيل السريعة المثلى بواسطة إنزيم Rapid PNGase F. س: ما هي الجليكوزيدازات وما استخداماتها؟ ج: تُستخدم الجليكوزيدازات للحصول على معلومات حول مجموعات الكربوهيدرات المرتبطة بالبروتينات السكرية والببتيدات السكرية. وهي نوعان: إندوغليكوزيدازات التي تفصل مجموعات الكربوهيدرات بالكامل عن البروتينات، وإكسوغليكوزيدازات التي تزيل السكريات الأحادية من النهايات غير المُختزلة للكربوهيدرات. أما النهاية المُختزلة فهي تلك التي يُنتجها إندوغليكوزيداز. غالبًا ما يستخدم الباحثون إندوغليكوزيداز متبوعًا بواحد أو أكثر من الإكسوغليكوزيدازات، ثم يحللون النواتج باستخدام SDS-PAGE أو أنواع مختلفة من الكروماتوغرافيا السائلة.