مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، P0704L، PNGase F

يُعدّ إنزيم PNGase F الطريقة الإنزيمية الأكثر فعالية لإزالة جميع السكريات تقريبًا. الفئات ذات الصلة : الإندوغليكوزيداز، تطبيقات تحليل البروتينات، أنظمة التعبير، تسلسل الغليكان، علم البروتينات. المواصفات : تعريف الوحدة : تُعرَّف الوحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لإزالة أكثر من 95% من الكربوهيدرات من 10 ميكروغرام من إنزيم RNase B المُسخَّن خلال ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر. طريقة التحضير: يتم تسخين 10 ميكروغرام من إنزيم RNase B باستخدام محلول تسخين البروتينات السكرية 1X (0.5% SDS، 40 ملي مولار DTT) عند درجة حرارة 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد إضافة NP-40 ومحلول GlycoBuffer 2، تُضاف تخفيفات متسلسلة من إنزيم PNGase F، ويُحضن مزيج التفاعل لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. يتم تصوير فصل نواتج التفاعل باستخدام SDS-PAGE. محلول مُزيل طبيعة البروتين السكري 1X: 0.5% SDS، 40 ملي مولار DTT، 1X NP-40، 1% NP-40 في ماء MilliQ-H₂O. شروط التفاعل: محلول GlycoBuffer 2 1X، حضانة عند 37 درجة مئوية. محلول GlycoBuffer 2 1X: 50 ملي مولار فوسفات الصوديوم (الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 20 ملي مولار Tris-HCl، 50 ملي مولار NaCl، 5 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري: 75 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الوزن الجزيئي الظاهري : 36000 دالتون. الأسئلة الشائعة: س: هل إنزيم PNGase F متوافق مع التحليلات اللاحقة مثل HPLC وقياس الطيف الكتلي؟ أ: تبيع شركة NEB نوعين من الإنزيم، هما PNGase F (NEB #P0704) وPNGase F (خالي من الجلسرين) (NEB #P0705). يتمتع كلا النوعين بنفس النشاط والنوعية والتركيز. الفرق الوحيد بينهما هو أن PNGase F يُخزن في محلول جلسرين بنسبة 50%، بينما لا يحتوي PNGase F (خالي من الجلسرين) على الجلسرين في محلول التخزين الخاص به. يُوصى باستخدام PNGase F (خالي من الجلسرين) عند إجراء تحليل لاحق باستخدام HPLC و/أو مطياف الكتلة، نظرًا لعدم تحمل هذه الأجهزة للجلسرين. لا يتوافق محلول إزالة طبيعة البروتينات السكرية (الذي يحتوي على SDS وDTT) مع تطبيقات مطياف الكتلة، وغالبًا ما يصعب إزالته من التفاعل. لذلك، نوصي باستخدام PNGase F (خالي من الجلسرين) في ظروف غير مُسببة لإزالة الطبيعة إذا تم استخدام HPLC أو مطياف الكتلة في التحليل اللاحق. غالبًا ما تتطلب الظروف غير المُفسِّخة عددًا أكبر من وحدات الإنزيم وفترة حضانة أطول. س: ماذا يحدث للأسباراجين بعد أن يزيل إنزيم PNGase السكر؟ ج: بما أن الإنزيم هو جليكوأميداز، فإن الأسباراجين يتحول إلى حمض الأسبارتيك. س: لماذا يتحلل البروتين المُستخلص بالترسيب المناعي (IP)؟ عندما أقوم بفسْخ البروتين وإضافة SDS، لا أرى على هلام SDS-PAGE سوى لطخة أو لا أرى أي بروتين؟ ج: عندما يُفسَّخ البروتين، يصبح أكثر عرضةً للتحلل بواسطة البروتيازات. لهذا السبب، يمكن استخدام مزيج من البروتيازات يحتوي على المكونات التالية في بروتوكول تفاعل PNGase F: أبروتينين (بتركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل)، بنزاميدين (بتركيز نهائي 1 ملي مولار)، بيبستاتين (بتركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل)، ليوبيبتين (بتركيز نهائي 1 ميكرومولار)، إي جي تي إيه (بتركيز نهائي 1 ملي مولار)، إي دي تي إيه (بتركيز نهائي 1 ملي مولار)، بي إم إس إف (بتركيز نهائي 1 ملي مولار). حضّر محلولًا مركزًا 1000 ضعف لكل مثبط في الماء، باستثناء البيبستاتين الذي يجب إذابته في الميثانول. ملاحظة: يتميز بي إم إس إف بقدرته على تعديل البقايا القاعدية على ركائز البروتين السكري. س: ما هي ظروف التفاعل النموذجية لـ PNGase F؟ ج: ظروف التفاعل النموذجية هي كما يلي: 1. امزج 1-20 ميكروغرام من البروتين السكري، و1 ميكرولتر من محلول إزالة طبيعة البروتين السكري 10X، والماء (إذا لزم الأمر) لتكوين حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر. ٢. قم بتعطيل البروتين السكري بتسخين التفاعل عند ١٠٠ درجة مئوية لمدة ١٠ دقائق. ٣. حضّر حجم تفاعل إجمالي قدره ٢٠ ميكرولتر بإضافة ٢ ميكرولتر من محلول غليكوبافر ٢ بتركيز ١٠X، و٢ ميكرولتر من محلول NP40 بتركيز ١٠٪، وماء، و١-٢ ميكرولتر من إنزيم PNGaseF. ٤. حضّن التفاعل عند ٣٧ درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ملاحظة: نوصي بتقليل كمية إنزيم PNGaseF إلى عُشر (أو أقل) من حجم التفاعل الإجمالي للحفاظ على تركيز الجلسرين النهائي مساويًا (أو أقل) من ٥٪. يمكن زيادة حجم التفاعل خطيًا لاستيعاب كميات كبيرة من إنزيم PNGaseF وأحجام تفاعل أكبر. س: هل يعمل إنزيم PNGase F في اليوريا؟ ج: إنزيم PNGase F مستقر في اليوريا بتركيز ٢.٥ مولار عند ٣٧ درجة مئوية لمدة ٢٤ ساعة، ويحتفظ بنسبة ٤٠٪ من نشاطه في اليوريا بتركيز ٥ مولار. 1. مالي، ف.، وآخرون، مجلة الكيمياء الحيوية التحليلية، 180، 195-204 (1989) س: كيف يمكنني تثبيط إنزيم PNGase F؟ ج: يُعدّ SDS مثبطًا ممتازًا لإنزيم PNGase F. س: ما هي كمية إنزيم PNGase F التي يجب استخدامها لإزالة الكربوهيدرات في الظروف الطبيعية؟ ج: عندما لا يكون البروتين مُشوّهًا، قد يواجه إنزيم PNGase F صعوبة في الوصول إلى موقع انقسام الكربوهيدرات (بسبب البنية الثانوية والثالثية للبروتين). في بعض الأحيان، قد يساعد استخدام كمية إضافية من الإنزيم وإطالة فترة الحضانة، ولكن هذه القيم خاصة بكل بروتين ويجب تحديدها تجريبيًا. س: جربتُ إنزيم PNGase F على بروتين سكري ولم ألاحظ إزالة الكربوهيدرات. ما المشكلة؟ ج: هل تعرف كيف ترتبط الكربوهيدرات بالبروتين؟ هل هي مرتبطة برابطة N أم O (مرتبطة بالأسباراجين، أو السيرين/الثريونين)؟ إنزيم PNGase F يزيل فقط الكربوهيدرات المرتبطة بالأسباراجين. إنزيم O-جليكوسيداز من شركة NEB (رقم المنتج P0733) يزيل الكربوهيدرات المرتبطة بروابط O من النوعين 1 و3 المرتبطة بالسيرين/ثريونين. إذا كنت متأكدًا من وجود كربوهيدرات مرتبطة بروابط N، فتأكد من فصل البروتين قبل إزالة الجليكوزيل. قد تمنع البنية الثانوية والثالثية للبروتينات إنزيمات الإندوجليكوسيداز من الوصول إلى ركائزها، مما يجعل فصل البروتين خطوة حاسمة في عملية الفصل الفعالة. إذا كنت لا ترغب في فصل البروتين، ففكر في إضافة المزيد من الإنزيم وزيادة مدة الحضانة. إذا قمت بفصل البروتين، فتأكد من إضافة NP-40 (لحماية إنزيم PNGase F من SDS في خطوة فصل البروتين). خارج ظروف التفاعل هذه، هناك احتمال أن تكون الكربوهيدرات مقاومة لإنزيم PNGase F (وهو أمر نادر الحدوث). يحدث هذا عندما يتم تعديل N-أسيتيل جلوكوزامين الأساسي بواسطة α1-3Fucose (يوجد غالبًا في البروتينات النباتية). س: ما الفرق بين PNGase F و Endo H و O-Glycosidase؟ ج: يزيل PNGase F جميع أنواع الغليكوزيل المرتبط بالنيتروجين (المرتبط بالأسباراجين)؛ بما في ذلك الغليكوزيل عالي المانوز، والغليكوزيل الهجين، والغليكوزيل ثنائي وثلاثي ورباعي التفرع. يُنصح باختيار هذا الإنزيم إذا كان الهدف هو إزالة جميع الكربوهيدرات المرتبطة بالنيتروجين بغض النظر عن نوعها. يزيل Endo H فقط الغليكوزيل عالي المانوز وبعض أنواع الكربوهيدرات الهجينة المرتبطة بالنيتروجين. يُنصح باختيار هذا الإنزيم لتحديد نوع الغليكوزيل المرتبط بالنيتروجين بدقة أكبر، أو إذا كان البروتين يحتوي على كربوهيدرات حساسة لـ Endo H. يزيل O-Glycosidase من NEB ثنائيات السكاريد المرتبطة بالنيتروجين من النوعين الأساسيين 1 و 3 منزوعة حمض السياليك والمرتبطة ببقايا السيرين/الثريونين. س: هل تُثبط المنظفات عمل الإكسوغليكوزيدازات/الإندوغليكوزيدازات؟ ج: عند مستويات معتدلة (0.5-1.0% من المنظفات الأيونية وغير الأيونية)، تُظهر معظم الجليكوسيدازات نشاطًا مُرضيًا أو لا تتأثر. الاستثناءات هي: PNGase F (جميع التركيبات)، وO-جليكوسيداز، وβ-N-أسيتيل جلوكوزامينيداز، والتي تُثبَّط بواسطة SDS. من الضروري إضافة NP-40 بتركيز نهائي 1% إلى مزيج التفاعل لمعادلة تثبيط المنظفات. يُثبَّط Endo D أيضًا بواسطة SDS، ولكن NP-40 لا يُعادل هذا التثبيط. أخيرًا، يمكن للمواد المُثبِّتة الشائعة، مثل توين، وتريتون X-100، وNP-40، وأوكتيل جلوكوزيد، وسلفوبيتينات غير مُنظِّفة، بالإضافة إلى آثار المذيبات العضوية، أن تمنع عملية إزالة الغليكوزيل السريعة المثلى بواسطة إنزيم Rapid PNGase F. س: لماذا غيّرت إنزيمات NEB Glycosidase محاليل التفاعل؟ ما هي محاليل التفاعل الجديدة، وهل لا يزال بإمكاني استخدام الإنزيم مع محلوله القديم؟ أين يمكنني العثور على تركيبة المحاليل القديمة؟ ج: لتبسيط إجراءات العمل والهضم باستخدام اثنين أو أكثر من إنزيمات exoglycosidase، يتم الآن تزويد معظم الإنزيمات بمحلول GlycoBuffer 1 بتركيز 10X. ويُستثنى من ذلك إنزيمان يتم تزويدهما بمحلول GlycoBuffer 4. كما تم تبسيط مجموعة محاليل الإندوغليكوزيداز. وقد تم تقييم نشاط كل إنزيم من إنزيمات endo- وexoglycosidase في كل من نظام المحلول القديم والجديد. تحتفظ جميع الإنزيمات إما بنفس النشاط، أو وُجد أن نشاطها قد ازداد في المحلول المنظم الجديد. لا تزال بعض الإكسوغليكوزيدازات مزودة بقارورة إضافية من rHSA (يعزز rHSA نشاط بعض الإنزيمات). وكما في السابق، لا تزال بعض الإكسوغليكوزيدازات مزودة بقارورة إضافية من BSA (يعزز BSA نشاط بعض الإنزيمات). ولا تزال المكونات الأخرى (مثل محلول إزالة طبيعة البروتينات السكرية، وNP-40، إلخ) متوفرة عند الحاجة. رقم منتج الإنزيم، المحلول المنظم القديم، المحلول المنظم الحالي، هل تم التغيير؟ إنزيم ألفا-إن-أسيتيل جالاكتوزامينيداز P0734 G7 جليكوبافر 1 نعم، إنزيم ألفا1-2 فوكوسيداز P0724 G4 جليكوبافر 1 نعم، إنزيم ألفا1-2،3،4،6 فوكوسيداز P0748 --- جليكوبافر 1 --- إنزيم ألفا1-2،4،6 فوكوسيداز O p0749 --- جليكوبافر 1 --- إنزيم ألفا1-3،4 فوكوسيداز p0769 --- جليكوبافر 1 --- إنزيم ألفا1-2،3 مانوسيداز P0729 G6 جليكوبافر 1 لا، إنزيم ألفا1-6 مانوسيداز P0727 G2 جليكوبافر 1 نعم، إنزيم ألفا1-2،3،6 مانوسيداز p0768 --- جليكوبافر 4 --- غالاكتوزيداز α1-3,4,6 P0747 --- غليكوبافر 1 ---- غالاكتوزيداز α1-3,6 P0731 G6 غليكوبافر 1 لا نيورامينيداز α2-3 S P0743 --- غليكوبافر 1 --- نيورامينيداز α2-3,6,8 P0720 G1 غليكوبافر 1 نعم نيورامينيداز α2-3,6,8,9 A P0722 --- غليكوبافر 1 --- β-N-أسيتيل هيكسوزامينيداز P0721 G2 غليكوبافر 1 نعم β-N-أسيتيل غلوكوزامينيداز P0732 G1 غليكوبافر 1 نعم β-N-أسيتيل غلوكوزامينيداز S P0744 --- غليكوبافر 1 --- β1-3 جالاكتوزيداز P0726 G6 GlycoBuffer 1 لا β1-4 جالاكتوزيداز S P0745 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3,4 جالاكتوزيداز p0746 --- GlycoBuffer 4 --- N-Glycan Sequencing Kit E0577 --- GlycoBuffer 1 --- Endo S P0741 G6 GlycoBuffer 1 نعم Endo H P0702 G5 GlycoBuffer 3 نعم Endo Hf P0703 G5 GlycoBuffer 3 نعم Endo F2 p0772 --- GlycoBuffer 4 --- Endo F3 p0771 --- GlycoBuffer 4 --- Endo D P0742 G7 GlycoBuffer 2 لا O-Glycosidase P0733 G7 مجموعة GlycoBuffer 2 بدون O-Glycosidase و Neuraminidase E0540 G7 GlycoBuffer 2 بدون Remove-iT® PNGase F P0706 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F P0704 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F (خالي من الجلسرين) P0705 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F، مُعاد التركيب P0708 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F (خالي من الجلسرين)، مُعاد التركيب P0709 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase A p0707 --- Glyco Buffer 3 --- مزيج إزالة الغليكوزيل من البروتين II p6044 --- مزيج إزالة الغليكوزيل Buffer 1 و 2 --- Rapid PNGase F P0710 --- Rapid PNGase F Buffer ---- Rapid™ PNGase F (صيغة غير مُختزلة) p0711 --- محلول منظم سريع لإنزيم PNGase F (صيغة غير مختزلة) س: ما هي الجليكوسيدازات وما استخداماتها؟ ج: تُستخدم الجليكوسيدازات للحصول على معلومات حول مجموعات الكربوهيدرات المرتبطة بالبروتينات السكرية والببتيدات السكرية. وهي نوعان: إندوجليكوسيدازات التي تفصل مجموعات الكربوهيدرات بالكامل عن البروتينات، وإكسوجليكوسيدازات التي تزيل السكريات الأحادية من النهايات غير المختزلة للكربوهيدرات. أما النهاية المختزلة فهي تلك التي يُنتجها إندوجليكوسيداز. غالبًا ما يستخدم الباحثون إندوجليكوسيداز متبوعًا بواحد أو أكثر من الإكسوجليكوسيدازات، ثم يحللون النواتج باستخدام SDS-PAGE أو أنواع مختلفة من الكروماتوغرافيا السائلة. س: ما هو ركيزة إندوجليكوسيداز جيدة؟ ج: بالنسبة لإنزيم PNGaseF ومزيج إزالة الجليكوزيل من البروتين، نقترح استخدام فيتوين (NEB #P6042، مُرفق مع مزيج إزالة الجليكوزيل من البروتين). بالنسبة لـ PNGaseF و Endo H و Endo Hf، نقترح استخدام RNase B (NEB #P7817). بالنسبة لـ Endo D، نقترح استخدام فوسفوليباز A من سم النحل. بالنسبة لـ Endo S، نقترح استخدام IgG أحادي النسيلة من الفأر (NEB #E8032). بالنسبة لـ O-جليكوسيداز، نقترح استخدام p-Nitrophenyl galacto-N-bioside (Galβ1-3GalNAcα1pNP، أو Core1-pNP). بدلاً من ذلك، يمكن هضم الفيوتين باستخدام نيورامينيداز، أو نيورامينيداز مع O-جليكوسيداز. يمكن ملاحظة التغيرات في الوزن الجزيئي بعد إزالة الجليكان باستخدام SDS-PAGE.