نيو إنجلاند بيولابس، P0705L، PNGase F (خالي من الجلسرين)

يُعدّ إنزيم PNGase F الطريقة الإنزيمية الأكثر فعالية لإزالة جميع السكريات تقريبًا. الفئات ذات الصلة : الإندوغليكوزيداز، تطبيقات تحليل البروتينات، أنظمة التعبير، تسلسل الغليكان، علم البروتينات. المواصفات : تعريف الوحدة : تُعرَّف الوحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لإزالة أكثر من 95% من الكربوهيدرات من 10 ميكروغرام من إنزيم RNase B المُسخَّن خلال ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر. طريقة التحضير: يتم تسخين 10 ميكروغرام من إنزيم RNase B باستخدام محلول تسخين البروتينات السكرية 1X (0.5% SDS، 40 ملي مولار DTT) عند درجة حرارة 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد إضافة NP-40 ومحلول GlycoBuffer 2، تُضاف تخفيفات متسلسلة من إنزيم PNGase F، ويُحضن مزيج التفاعل لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. يتم تصوير فصل نواتج التفاعل باستخدام SDS-PAGE. محلول مُزيل طبيعة البروتين السكري 1X: 0.5% SDS، 40 ملي مولار DTT، 1X NP-40، 1% NP-40 في ماء MilliQ-H₂O. شروط التفاعل: محلول GlycoBuffer 2 1X، حضانة عند 37 درجة مئوية. محلول GlycoBuffer 2 1X: 50 ملي مولار فوسفات الصوديوم (الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 20 ملي مولار Tris-HCl، 50 ملي مولار NaCl، 5 ملي مولار EDTA، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري : 75 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الوزن الجزيئي الظاهري : 36000 دالتون. الأسئلة الشائعة : س: هل إنزيم PNGase F متوافق مع التحليلات اللاحقة مثل HPLC وقياس الطيف الكتلي؟ أ: تبيع شركة NEB نوعين من الإنزيم، هما PNGase F (NEB #P0704) وPNGase F (خالي من الجلسرين) (NEB #P0705). يتمتع كلا النوعين بنفس النشاط والنوعية والتركيز. الفرق الوحيد بينهما هو أن PNGase F يُخزن في محلول جلسرين بنسبة 50%، بينما لا يحتوي PNGase F (خالي من الجلسرين) على الجلسرين في محلول التخزين الخاص به. يُوصى باستخدام PNGase F (خالي من الجلسرين) عند إجراء تحليل لاحق باستخدام HPLC و/أو مطياف الكتلة، نظرًا لعدم تحمل هذه الأجهزة للجلسرين. لا يتوافق محلول إزالة طبيعة البروتينات السكرية (الذي يحتوي على SDS وDTT) مع تطبيقات مطياف الكتلة، وغالبًا ما يصعب إزالته من التفاعل. لذلك، نوصي باستخدام PNGase F (خالي من الجلسرين) في ظروف غير مُسببة لإزالة الطبيعة إذا تم استخدام HPLC أو مطياف الكتلة في التحليل اللاحق. غالبًا ما تتطلب الظروف غير المُفسِّخة وحدات إنزيمية أكثر وفترة حضانة أطول. س: لماذا يتحلل البروتين المُستخلص بالترسيب المناعي (IP)؟ عندما أقوم بفسْخ البروتين وإضافة SDS، لا أرى على هلام SDS-PAGE سوى لطخة أو لا أرى أي بروتين؟ ج: عندما يُفسَّخ البروتين، يصبح أكثر عرضةً للتحلل بواسطة البروتيازات. لهذا السبب، يمكن استخدام مزيج بروتياز يحتوي على ما يلي في بروتوكول تفاعل PNGase F: أبروتينين (تركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل)، بنزاميدين (تركيز نهائي 1 ملي مولار)، بيبستاتين (تركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل)، ليوبيبتين (تركيز نهائي 1 ميكرومولار)، EGTA (تركيز نهائي 1 ملي مولار)، EDTA (تركيز نهائي 1 ملي مولار)، PMSF (تركيز نهائي 1 ملي مولار). حضِّر محلولًا مركزًا 1000 ضعف من كل مُثبِّط في الماء؛ باستثناء البيبستاتين الذي يجب إذابته في الميثانول. ملاحظة: يتمتع PMSF بالقدرة على تعديل البقايا القاعدية على ركائز البروتينات السكرية. س: هل تُثبّط المنظفات الإكسوغليكوزيداز/الإندوغليكوزيداز؟ ج: عند مستويات معتدلة (0.5-1.0% من المنظفات الأيونية وغير الأيونية)، تُظهر معظم الجليكوزيدازات نشاطًا مُرضيًا أو لا تتأثر. الاستثناءات هي: PNGase F (جميع التركيبات)، وO-غليكوزيداز، وβ-N-أسيتيل جلوكوزامينيداز، والتي تُثبّط بواسطة SDS. من الضروري إضافة NP-40 بتركيز نهائي 1% إلى خليط التفاعل لمواجهة تثبيط المنظفات. يُثبّط Endo D أيضًا بواسطة SDS، ولكن NP-40 لا يُعاكس هذا التثبيط. أخيرًا، يمكن للمواد المُثبِّتة الشائعة مثل توين، وتريتون X-100، وNP-40، وأوكتيل جلوكوزيد، وسلفوبيتينات غير مُنظِّفة، بالإضافة إلى آثار المذيبات العضوية، أن تمنع عملية إزالة الغليكوزيل السريعة المثلى بواسطة إنزيم PNGase F السريع. س: هل يعمل إنزيم PNGase F في اليوريا؟ ج: إنزيم PNGase F مستقر في محلول يوريا بتركيز 2.5 مولار عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة، ويحتفظ بنسبة 40% من نشاطه في محلول يوريا بتركيز 5 مولار.^1.1 مالي، ف.، وآخرون، مجلة الكيمياء الحيوية التحليلية، 180، 195-204 (1989). س: كيف يمكنني تثبيط إنزيم PNGase F؟ ج: يُعدّ SDS مُثبِّطًا ممتازًا لإنزيم PNGase F. س: ما هي كمية إنزيم PNGase F التي يجب استخدامها لإزالة الكربوهيدرات في الظروف الطبيعية؟ ج: عندما لا يكون البروتين مُشوَّهًا، قد يواجه إنزيم PNGase F صعوبة في الوصول إلى موقع انقسام الكربوهيدرات (بسبب البنية الثانوية والثالثية للبروتين). في بعض الأحيان، قد يُساعد استخدام كمية إضافية من الإنزيم وإطالة فترة الحضانة، ولكن هذه القيم خاصة بكل بروتين ويجب تحديدها تجريبيًا. س: ما الفرق بين PNGase F و Endo H و O-Glycosidase؟ ج: يُزيل PNGase F جميع أنواع الغليكوزيل المرتبط بالنيتروجين (المرتبط بالأسباراجين)؛ مثل الغليكوزيل عالي المانوز، والغليكوزيل الهجين، والغليكوزيل ثنائي وثلاثي ورباعي التفرع. ستختار هذا الإنزيم إذا كان هدفك هو إزالة جميع الكربوهيدرات المرتبطة بالنيتروجين بغض النظر عن نوعها. أما Endo H فيُزيل فقط الغليكوزيل عالي المانوز وبعض أنواع الكربوهيدرات الهجينة المرتبطة بالنيتروجين. يمكنك اختيار هذا الإنزيم لتحديد نوع الارتباط بالجليكوزيل N بدقة أكبر، أو إذا كنت تعلم أن البروتين يحتوي على كربوهيدرات حساسة لإنزيم Endo H. يقوم إنزيم O-Glycosidase من NEB بإزالة ثنائيات السكاريد المرتبطة بـ O من النوعين الأساسيين 1 و3، والمرتبطة ببقايا سيرين/ثريونين، بعد إزالة حمض السياليك. س: جربتُ إنزيم PNGase F على بروتين سكري ولم ألاحظ إزالة الكربوهيدرات. ما المشكلة؟ ج: هل تعرف كيف ترتبط الكربوهيدرات بالبروتين؟ هل هي مرتبطة بـ N أم O (مرتبطة بأسباراجين، أو سيرين/ثريونين)؟ يزيل إنزيم PNGase F الكربوهيدرات المرتبطة بالأسباراجين فقط. أما إنزيم O-Glycosidase من NEB (رقم المنتج P0733) فيزيل الكربوهيدرات المرتبطة بـ O من النوعين الأساسيين 1 و3، والمرتبطة بسيرين/ثريونين. إذا كنت متأكدًا من وجود كربوهيدرات مرتبطة بـ N، فتأكد من فصل البروتين قبل إزالة الجليكوزيل. قد تمنع البنية الثانوية والثالثية للبروتينات إنزيمات الإندوغليكوزيداز من الوصول إلى ركائزها، مما يجعل عملية التمسخ خطوة حاسمة في عملية التحلل الفعال. إذا كنت لا ترغب في حدوث التمسخ، فضع في اعتبارك إضافة المزيد من الإنزيم وزيادة مدة الحضانة. أما إذا قمت بتمسخ البروتين، فتأكد من إضافة NP-40 (لحماية إنزيم PNGase F من SDS في خطوة التمسخ). خارج ظروف التفاعل هذه، هناك احتمال أن تكون الكربوهيدرات مقاومة لإنزيم PNGase F (وهو أمر نادر الحدوث). يحدث هذا عندما يتم تعديل N-أسيتيل-غلوكوزامين الأساسي بواسطة α1-3Fucose (يوجد غالبًا في البروتينات النباتية). سؤال: لماذا غيّرت إنزيمات NEB Glycosidase محاليل التفاعل؟ ما هي محاليل التفاعل الجديدة، وهل لا يزال بإمكاني استخدام الإنزيم مع محلوله القديم؟ أين يمكنني العثور على تركيبة المحاليل القديمة؟ ج: لتبسيط سير العمل وعمليات الهضم باستخدام اثنين أو أكثر من الإكسوغليكوزيدازات، تُزوَّد معظم الإنزيمات الآن بمحلول غليكوبفر 1 بتركيز 10X. ويُستثنى من ذلك إنزيمان يُزوَّدان بمحلول غليكوبفر 4. كما تم تبسيط مجموعة المحاليل المنظمة للإندوغليكوزيدازات. وقد تم تقييم نشاط كل إنزيم من الإندوغليكوزيدازات والإكسوغليكوزيدازات في كلٍّ من نظام المحلول المنظم القديم والجديد. احتفظت جميع الإنزيمات إما بنفس النشاط، أو وُجد أن نشاطها أكبر في المحلول المنظم الجديد. لا تزال بعض الإكسوغليكوزيدازات تُزوَّد بقارورة إضافية من rHSA (يعزز rHSA نشاط بعض الإنزيمات). وكما كان الحال سابقًا، لا تزال بعض الإكسوغليكوزيدازات تُزوَّد بقارورة إضافية من BSA (يعزز BSA نشاط بعض الإنزيمات). ولا تزال المكونات الأخرى (مثل محلول تمسخ البروتين السكري، وNP-40، وما إلى ذلك) متوفرة عند الحاجة. رقم منتج الإنزيم، المحلول المنظم القديم، المحلول المنظم الحالي، هل تم التغيير؟ إنزيم ألفا-إن-أسيتيل جالاكتوزامينيداز P0734 G7 جليكوبافر 1 نعم، إنزيم ألفا1-2 فوكوسيداز P0724 G4 جليكوبافر 1 نعم، إنزيم ألفا1-2،3،4،6 فوكوسيداز P0748 --- جليكوبافر 1 --- إنزيم ألفا1-2،4،6 فوكوسيداز O p0749 --- جليكوبافر 1 --- إنزيم ألفا1-3،4 فوكوسيداز p0769 --- جليكوبافر 1 --- إنزيم ألفا1-2،3 مانوسيداز P0729 G6 جليكوبافر 1 لا، إنزيم ألفا1-6 مانوسيداز P0727 G2 جليكوبافر 1 نعم، إنزيم ألفا1-2،3،6 مانوسيداز p0768 --- جليكوبافر 4 --- غالاكتوزيداز α1-3,4,6 P0747 --- غليكوبافر 1 ---- غالاكتوزيداز α1-3,6 P0731 G6 غليكوبافر 1 لا نيورامينيداز α2-3 S P0743 --- غليكوبافر 1 --- نيورامينيداز α2-3,6,8 P0720 G1 غليكوبافر 1 نعم نيورامينيداز α2-3,6,8,9 A P0722 --- غليكوبافر 1 --- β-N-أسيتيل هيكسوزامينيداز P0721 G2 غليكوبافر 1 نعم β-N-أسيتيل غلوكوزامينيداز P0732 G1 غليكوبافر 1 نعم β-N-أسيتيل غلوكوزامينيداز S P0744 --- غليكوبافر 1 --- β1-3 جالاكتوزيداز P0726 G6 GlycoBuffer 1 لا β1-4 جالاكتوزيداز S P0745 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3,4 جالاكتوزيداز p0746 --- GlycoBuffer 4 --- N-Glycan Sequencing Kit E0577 --- GlycoBuffer 1 --- Endo S P0741 G6 GlycoBuffer 1 نعم Endo H P0702 G5 GlycoBuffer 3 نعم Endo Hf P0703 G5 GlycoBuffer 3 نعم Endo F2 p0772 --- GlycoBuffer 4 --- Endo F3 p0771 --- GlycoBuffer 4 --- Endo D P0742 G7 GlycoBuffer 2 لا O-Glycosidase P0733 G7 مجموعة GlycoBuffer 2 بدون O-Glycosidase و Neuraminidase E0540 G7 GlycoBuffer 2 بدون Remove-iT® PNGase F P0706 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F P0704 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F (خالي من الجلسرين) P0705 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F، مُعاد التركيب P0708 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F (خالي من الجلسرين)، مُعاد التركيب P0709 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase A p0707 --- Glyco Buffer 3 --- مزيج إزالة الغليكوزيل من البروتين II p6044 --- مزيج إزالة الغليكوزيل Buffer 1 و 2 --- Rapid PNGase F P0710 --- Rapid PNGase F Buffer ---- Rapid™ PNGase F (صيغة غير مُختزلة) p0711 --- محلول منظم سريع لإنزيم PNGase F (صيغة غير مختزلة) س: ما هي الجليكوسيدازات وما استخداماتها؟ ج: تُستخدم الجليكوسيدازات للحصول على معلومات حول مجموعات الكربوهيدرات المرتبطة بالبروتينات السكرية والببتيدات السكرية. وهي نوعان: إندوجليكوسيدازات التي تفصل مجموعات الكربوهيدرات بالكامل عن البروتينات، وإكسوجليكوسيدازات التي تزيل السكريات الأحادية من النهايات غير المختزلة للكربوهيدرات. أما النهاية المختزلة فهي تلك التي يُنتجها إندوجليكوسيداز. غالبًا ما يستخدم الباحثون إندوجليكوسيداز متبوعًا بواحد أو أكثر من الإكسوجليكوسيدازات، ثم يحللون النواتج باستخدام SDS-PAGE أو أنواع مختلفة من الكروماتوغرافيا السائلة. س: ما هو ركيزة إندوجليكوسيداز جيدة؟ ج: بالنسبة لإنزيم PNGaseF ومزيج إزالة الجليكوزيل من البروتين، نقترح استخدام فيتوين (NEB #P6042، مُرفق مع مزيج إزالة الجليكوزيل من البروتين). بالنسبة لـ PNGaseF و Endo H و Endo Hf، نقترح استخدام RNase B (NEB #P7817). بالنسبة لـ Endo D، نقترح استخدام فوسفوليباز A من سم النحل. بالنسبة لـ Endo S، نقترح استخدام IgG أحادي النسيلة من الفأر (NEB #E8032). بالنسبة لـ O-جليكوسيداز، نقترح استخدام p-Nitrophenyl galacto-N-bioside (Galβ1-3GalNAcα1pNP، أو Core1-pNP). بدلاً من ذلك، يمكن هضم الفيوتين باستخدام نيورامينيداز، أو نيورامينيداز مع O-جليكوسيداز. يمكن ملاحظة التغيرات في الوزن الجزيئي بعد إزالة الجليكان باستخدام SDS-PAGE.