مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، P0707S، PNGase A

يقوم إنزيم PNGase A بفصل السكريات قليلة الوحدات المعقدة القصيرة، مثل تلك الموجودة في الخلايا النباتية والحشرية، بين بقايا N-أسيتيل جلوكوزامين (GlcNAc) وأسباراجين في جزيئات المانوز العالية، والهجينة، مثل تلك الموجودة في الخلايا النباتية والحشرية، من البروتينات السكرية والببتيدات السكرية المرتبطة بالنيتروجين. ويختلف PNGase A عن PNGase F في أنه يفصل السكريات المرتبطة بالنيتروجين مع أو بدون بقايا فوكوز أساسية مرتبطة برابطة α(1,3). التصنيفات ذات الصلة: الإنزيمات المحللة للسكريات الداخلية، تطبيقات تحليل البروتينات، أنظمة التعبير، علم الأحياء السكرية وعلم البروتينات، علم البروتينات، تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لإزالة أكثر من 95% من الكربوهيدرات من 1 ميكروغرام من الأفيدين المؤتلف المُنتَج في الذرة خلال ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول غليكوبافر 3 بتركيز 1X، حضانة عند 37 درجة مئوية. محلول غليكوبافر 3 بتركيز 1X، 50 ملي مولار أسيتات الصوديوم (الأس الهيدروجيني 6 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 20 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 50 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 5 ملي مولار إيدتا، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري : 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الوزن الجزيئي الظاهري : 63.8 كيلو دالتون. شروط فحص الوحدة: يتم تسخين 1 ميكروغرام من الأفيدين المؤتلف باستخدام محلول غليكوبروتين ديناتشرينغ بتركيز 1X عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد إضافة NP-40 ومحلول غليكوبافر 3، يتم إضافة تخفيفات متسلسلة من إنزيم PNGase A، ويتم حضانة مزيج التفاعل لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. يتم تصوير فصل نواتج التفاعل باستخدام SDS-PAGE. الأسئلة الشائعة : س: ما الفرق بين إنزيم PNGase F وإنزيم PNGase A؟ ج: يقوم كل من إنزيم PNGase F وإنزيم PNGase A بفصل السكريات المرتبطة بالنيتروجين بين بقايا N-أسيتيل جلوكوزامين (GlcNAc) والأسباراجين الداخلية في كل من البروتينات السكرية والببتيدات السكرية. يستطيع إنزيم PNGase F فصل جميع السكريات المرتبطة بالنيتروجين تقريبًا من السكريات قليلة الوحدات الغنية بالمانوز، والهجينة، والمعقدة. مع ذلك، لا يستطيع إنزيم PNGase F فصل السكريات المرتبطة بالنيتروجين ذات الفوكوزيل α1-3 في النواة. في المقابل، يفصل إنزيم PNGase A السكريات المرتبطة بالنيتروجين من السكريات قليلة الوحدات الغنية بالمانوز، والهجينة، والمعقدة القصيرة، مثل تلك الموجودة في الخلايا النباتية والحشرية. يختلف إنزيم PNGase A عن إنزيم PNGase F في أنه يفصل السكريات المرتبطة بالنيتروجين سواءً بوجود بقايا فوكوز α(1,3) في النواة أو بدونها. س: هل يمكن استخدام إنزيم PNGase A في ظروف غير مُفسِّخة (طبيعية)؟ ج: لا، يتطلب إنزيم PNGase A أن يكون البروتين السكري مُختزلاً جزئياً على الأقل قبل إزالة الغليكوزيل. نوصي باستخدام PNGase A مع DTT فقط بتركيز نهائي 40 ملي مولار. يجب تسخين التفاعل عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ثم تبريده قبل إضافة PNGase A. قد يكون من الضروري زيادة كمية PNGase A أو إطالة مدة الحضانة عند 37 درجة مئوية لتحقيق إزالة كاملة للغليكوزيل. س: ما هي تراكيب المانوز العالية التي يستطيع PNGase A شطرها؟ ج: يستطيع PNGase A شطر تراكيب N-غليكان المانوز العالية من Man 3 إلى Man 9. س: هل يستطيع PNGase A شطر السكريات قليلة الوحدات الكبيرة والمعقدة؟ ج: لا يستطيع PNGase A شطر N-غليكانات الكبيرة مثل تلك الموجودة في الفيوتين، والفيبرينوجين، وIgG، واللاكتوفيرين، والترانسفيرين. س: ماذا يحدث للأسباراجين بعد أن يزيل PNGase A السكر؟ ج: بما أن الإنزيم هو جليكوأميداز، فإن الأسباراجين يتحول إلى حمض الأسبارتيك. س: ما هو الركيزة المناسبة لإنزيم PNGase A؟ ج: يقوم إنزيم PNGase A من شركة NEB بتحليل كل من البروتينات السكرية والببتيدات السكرية. نقترح استخدام الأفيدين المؤتلف من الذرة، أو بيروكسيداز الفجل (HRP) كضوابط إيجابية. س: هل يتوافق إنزيم PNGase A مع التحليلات اللاحقة مثل كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء (HPLC) وقياس الطيف الكتلي؟ ج: يُزوَّد إنزيم PNGase A في محلول تخزين خالٍ من الجلسرين لضمان التوافق مع التحليلات اللاحقة مثل HPLC و/أو قياس الطيف الكتلي، نظرًا لأن الجلسرين غير مسموح به في هذه الأجهزة. لا يتوافق محلول فصل البروتينات السكرية (الذي يحتوي على SDS وDTT) مع تطبيقات قياس الطيف الكتلي، وغالبًا ما يصعب إزالته من التفاعل. لذلك، لإنشاء تفاعل متوافق مع قياس الطيف الكتلي، نوصي باستخدام إنزيم PNGase A مع DTT فقط بتركيز نهائي 40 ملي مولار. يجب تسخين التفاعل عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ثم تبريده قبل إضافة إنزيم PNGase A. قد يكون من الضروري زيادة كمية إنزيم PNGase A أو إطالة فترة الحضانة عند 37 درجة مئوية لتحقيق إزالة كاملة للسكريات. س: ما هي كمية إنزيم PNGase A التي يجب استخدامها لإزالة الكربوهيدرات في الظروف الطبيعية أو ظروف التمسخ باستخدام DTT؟ ج: عندما لا يتم تمسخ البروتين باستخدام SDS، يتعين على إنزيم PNGase A بذل جهد أكبر للوصول إلى موقع انقسام الكربوهيدرات (بسبب البنية الثانوية والثالثية للبروتين). في بعض الأحيان، يمكن أن يساعد استخدام إنزيم إضافي وإطالة فترة الحضانة، ولكن هذه القيم خاصة بكل بروتين ويجب تحديدها تجريبيًا. س: لماذا يتحلل البروتين؟ عندما أقوم بتمسخ البروتين وإضافة SDS، لا أرى على هلام SDS-PAGE سوى لطخة أو لا أرى أي بروتين. هل يمكن استخدام مزيج مثبطات البروتياز في تفاعل PNGase A؟ ج: عندما يتم تمسخ البروتين، يصبح أكثر عرضة للانقسام بواسطة البروتيازات. لهذا السبب، يمكن استخدام مزيج من البروتيازات يحتوي على ما يلي في بروتوكول تفاعل PNGase A: أبروتينين (بتركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل)، بنزاميدين (بتركيز نهائي 1 ملي مولار)، بيبستاتين (بتركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل)، ليوبيبتين (بتركيز نهائي 1 ميكرومولار)، إي جي تي إيه (بتركيز نهائي 1 ملي مولار)، إي دي تي إيه (بتركيز نهائي 1 ملي مولار)، بي إم إس إف (بتركيز نهائي 1 ملي مولار). حضّر محلولًا مركزًا 1000 ضعف لكل مثبط في الماء، باستثناء البيبستاتين الذي يجب إذابته في الميثانول. ملاحظة: يتميز بي إم إس إف بقدرته على تعديل البقايا القاعدية على ركائز البروتينات السكرية. س: ما هي الجليكوسيدازات وما استخداماتها؟ ج: تُستخدم الجليكوسيدازات للحصول على معلومات حول مجموعات الكربوهيدرات المرتبطة بالبروتينات السكرية والببتيدات السكرية. تأتي هذه الإنزيمات بنوعين: إنزيمات التحلل السكري الداخلي التي تفصل مجموعات الكربوهيدرات الكاملة عن البروتينات، وإنزيمات التحلل السكري الخارجي التي تزيل السكريات الأحادية من النهايات غير المختزلة للكربوهيدرات. أما النهاية المختزلة فهي تلك التي ينتجها إنزيم التحلل السكري الداخلي. يستخدم الباحثون عادةً إنزيم التحلل السكري الداخلي متبوعًا بواحد أو أكثر من إنزيمات التحلل السكري الخارجي، ثم يحللون النواتج باستخدام تقنية الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE أو أنواع مختلفة من الاستشراب السائل.