نيو إنجلاند بيولابس، P0708S، PNGase F، مُعاد التركيب

يُعدّ إنزيم PNGase F الطريقة الإنزيمية الأكثر فعالية لإزالة جميع السكريات تقريبًا. التصنيفات ذات الصلة : إنزيمات التحلل الداخلي، تطبيقات تحليل البروتينات، أنظمة التعبير، تسلسل السكريات، علم البروتينات. المواصفات : تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لإزالة أكثر من 95% من الكربوهيدرات من 10 ميكروغرام من إنزيم RNase B المُحَوَّل في غضون ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر. طريقة التحضير: يتم تحوير 10 ميكروغرام من إنزيم RNase B باستخدام محلول مُحَوِّل للبروتينات السكرية بتركيز 1X (0.5% SDS، 40 ملي مولار DTT) عند درجة حرارة 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد إضافة NP-40 ومحلول GlycoBuffer 2، تُضاف تخفيفات متسلسلة من إنزيم PNGase F، ويُحضن مزيج التفاعل لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. يتم تصوير فصل نواتج التفاعل بواسطة تقنية SDS-PAGE. محلول تسييل البروتين السكري 1X، 0.5% SDS، 40 ملي مولار DTT، 1X NP-40، 1% NP-40 في MilliQ-H₂O. شروط التفاعل: محلول غليكوبافر 2 1X، حضانة عند 37 درجة مئوية. محلول غليكوبافر 2 1X، 50 ملي مولار فوسفات الصوديوم (الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين : 50 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 20 ملي مولار Tris-HCl، 5 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري : 75 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الوزن الجزيئي الظاهري : 36000 دالتون. الأسئلة الشائعة: س: هل هناك فرق بين PNGase F (P0704/P0705) وPNGase F المؤتلف (P0708/P0709)؟ ج: يُستخلص إنزيم PNGase F (P0704/P0705) من بكتيريا Elizabethkingia miricola (المعروفة سابقًا باسم Flavobacterium meningosepticum). أما إنزيم PNGase F المُعاد تركيبه (P0708/P0709) فيُستنسخ من بكتيريا Elizabethkingia miricola ويُعبَّر عنه في بكتيريا الإشريكية القولونية. لم نرصد أي اختلافات بين النسختين الأصلية والمُعاد تركيبها من إنزيم PNGase F. تتمتع النسختان من الإنزيم بنفس النشاط والنوعية والتركيز. س: حاولتُ إزالة السكريات من بروتيني السكري باستخدام Remove-iT® PNGase F، لكنني لم ألاحظ إزالة الكربوهيدرات. ما المشكلة؟ ج: هل تعرف كيف ترتبط الكربوهيدرات بالبروتين؟ هل هي مرتبطة برابطة N أم O (مرتبطة بالأسباراجين، أو السيرين/الثريونين)؟ يُزيل Remove-iT® PNGase F الكربوهيدرات المرتبطة بالأسباراجين فقط. إنزيم O-جليكوسيداز من شركة NEB (رقم المنتج P0733) يزيل الكربوهيدرات المرتبطة بروابط O من النوعين 1 و3 المرتبطة بالسيرين/ثريونين. إذا لم تلاحظ إزالة الجليكوزيل، وكنت تعلم أن البروتين يحتوي على جليكانات N، فضع في اعتبارك إضافة المزيد من الإنزيم وزيادة مدة الحضانة. إذا اخترتَ تغيير طبيعة البروتين السكري، فتأكد من إضافة NP-40 (لحماية إنزيم PNGase F المؤتلف من SDS في خطوة تغيير الطبيعة). خارج ظروف التفاعل هذه، هناك احتمال أن تكون الكربوهيدرات مقاومة لإنزيم PNGase F المؤتلف (وهو أمر نادر الحدوث). يحدث هذا عندما يتم تعديل N-أسيتيل جلوكوزامين الأساسي بواسطة α1-3Fucose (يوجد غالبًا في بروتينات النباتات والحشرات). س: ماذا يحدث للأسباراجين بعد أن يزيل إنزيم PNGase السكر؟ ج: بما أن الإنزيم هو جليكوأميداز، فإن الأسباراجين يتحول إلى حمض الأسبارتيك. س: لماذا يتحلل البروتين؟ عندما أقوم بتفكيك البروتين وإضافة SDS، لا أرى على هلام SDS-PAGE سوى لطخة أو لا أرى أي بروتين. هل يمكن استخدام مزيج مثبطات البروتياز في تفاعل PNGase F المؤتلف؟ ج: عندما يتم تفكيك البروتين، يصبح أكثر عرضة للتحلل بواسطة البروتيازات. لهذا السبب، يمكن استخدام مزيج بروتياز يحتوي على ما يلي في بروتوكول تفاعل PNGase F المؤتلف: أبروتينين (تركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل)، بنزاميدين (تركيز نهائي 1 ملي مولار)، بيبستاتين (تركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل)، ليوبيبتين (تركيز نهائي 1 ميكرومولار)، EGTA (تركيز نهائي 1 ملي مولار)، EDTA (تركيز نهائي 1 ملي مولار)، PMSF (تركيز نهائي 1 ملي مولار). حضّر محلولًا مركزًا 1000 ضعف من كل مثبط في الماء، باستثناء البيبستاتين الذي يجب إذابته في الميثانول. ملاحظة: PMSF لديه القدرة على تعديل البقايا القاعدية على ركائز البروتين السكري. س: ما الفرق بين PNGase F و Endo H و O-Glycosidase؟ ج: يزيل PNGase F جميع أنواع الغليكوزيل المرتبط بالنيتروجين (المرتبط بالأسباراجين)؛ بما في ذلك الغليكوزيل عالي المانوز، والغليكوزيل الهجين، والغليكوزيل ثنائي وثلاثي ورباعي التفرع. يُنصح باختيار هذا الإنزيم إذا كان الهدف هو إزالة جميع الكربوهيدرات المرتبطة بالنيتروجين بغض النظر عن نوعها. يزيل Endo H فقط الغليكوزيل عالي المانوز وبعض أنواع الغليكوزيل الهجين المرتبط بالنيتروجين. يُنصح باختيار هذا الإنزيم لتحديد نوع الغليكوزيل المرتبط بالنيتروجين بدقة أكبر، أو إذا كان البروتين يحتوي على كربوهيدرات حساسة لـ Endo H. يزيل O-Glycosidase من NEB ثنائيات السكاريد المرتبطة بالنيتروجين من النوعين الأساسيين 1 و 3 منزوعة حمض السياليك والمرتبطة ببقايا السيرين/الثريونين. س: هل يعمل PNGase F في اليوريا؟ ج: إنزيم PNGase F مستقر في محلول اليوريا بتركيز 2.5 مولار عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة، ويحتفظ بنسبة 40% من نشاطه في محلول اليوريا بتركيز 5 مولار.^1.1 (مالي وآخرون، Anal Biochem، 180، 195-204 (1989)). س: ما هي ظروف التفاعل النموذجية لإنزيم PNGase F المُعاد تركيبه؟ ج: ظروف التفاعل النموذجية هي كما يلي: يجب تحديد أوقات الحضانة المثلى وتركيزات الإنزيم تجريبيًا لكل ركيزة على حدة. امزج 1-20 ميكروغرام من البروتين السكري، و1 ميكرولتر من محلول مُزيل طبيعة البروتين السكري بتركيز 10X، والماء (إذا لزم الأمر) لتكوين حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر. قم بفصل البروتين السكري عن طريق تسخين التفاعل عند درجة حرارة 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. حضّر حجم تفاعل إجمالي قدره 20 ميكرولتر بإضافة 2 ميكرولتر من محلول غليكوبافر 2 بتركيز 10X، و2 ميكرولتر من محلول NP40 بتركيز 10%، وماء، و1-5 ميكرولتر من إنزيم PNGase F المؤتلف. حضّن التفاعل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ملاحظة: يمكن زيادة حجم التفاعلات خطيًا لاستيعاب أحجام تفاعل أكبر. س: ما كمية إنزيم PNGase F المؤتلف التي يجب استخدامها لإزالة الكربوهيدرات في الظروف الطبيعية أو ظروف التمسخ باستخدام DTT؟ ج: عندما لا يتم تمسخ البروتين باستخدام SDS، يبذل إنزيم PNGase F المؤتلف جهدًا أكبر للوصول إلى موقع انقسام الكربوهيدرات (بسبب البنية الثانوية والثالثية للبروتين). في بعض الأحيان، قد يساعد استخدام كمية إضافية من الإنزيم وإطالة مدة التحضين، ولكن هذه القيم خاصة بكل بروتين ويجب تحديدها تجريبيًا. س: كيف يمكنني تثبيط إنزيم PNGase F المؤتلف؟ ج: يُعدّ SDS مثبطًا ممتازًا لإنزيم PNGase F المُعاد تركيبه. س: هل يتوافق إنزيم PNGase F المُعاد تركيبه مع التحليلات اللاحقة مثل HPLC وقياس الطيف الكتلي؟ ج: تُسوّق شركة NEB نوعين من الإنزيم، وهما PNGase F المُعاد تركيبه (NEB #P0708) وPNGase F المُعاد تركيبه (الخالي من الجلسرين) (NEB #P0709). يتمتع كلا النوعين بنفس النشاط والنوعية والتركيز. الفرق الوحيد بينهما هو أن PNGase F المُعاد تركيبه يُخزّن في محلول جلسرين بنسبة 50%، بينما لا يحتوي PNGase F المُعاد تركيبه (الخالي من الجلسرين) على الجلسرين في محلول التخزين. يُوصى باستخدام PNGase F المُعاد تركيبه (الخالي من الجلسرين) عند إجراء التحليلات اللاحقة باستخدام HPLC و/أو قياس الطيف الكتلي، نظرًا لعدم تحمل هذه الأجهزة للجلسرين. لا يتوافق محلول إزالة طبيعة البروتينات السكرية (الذي يحتوي على SDS وDTT) مع تطبيقات مطياف الكتلة، وغالبًا ما يصعب إزالته من التفاعل. لذلك، نوصي باستخدام إنزيم PNGase F (الخالي من الجلسرين)، المُعاد تركيبه، في ظروف غير مُسببة لإزالة الطبيعة إذا كان سيتم استخدام HPLC أو MS للتحليل اللاحق. تتطلب الظروف غير المُسببة لإزالة الطبيعة عادةً وحدات إنزيمية أكثر وفترة حضانة أطول. س: ما هي الجليكوزيدازات وما استخداماتها؟ ج: تُستخدم الجليكوزيدازات للحصول على معلومات حول مجموعات الكربوهيدرات المرتبطة بالبروتينات السكرية والببتيدات السكرية. وهي نوعان: إندوجليكوزيدازات التي تفصل مجموعات الكربوهيدرات بالكامل من البروتينات، وإكسوجليكوزيدازات التي تزيل السكريات الأحادية من النهايات غير المُختزلة للكربوهيدرات. النهاية المُختزلة هي تلك التي يُنتجها إندوجليكوزيداز. يستخدم الباحثون عادةً إنزيمًا داخليًا للغليكوزيداز متبوعًا بواحد أو أكثر من الإكسوغليكوزيدازات، ثم يحللون النواتج باستخدام تقنية الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE أو أنواع مختلفة من الاستشراب السائل. س: هل تُثبِّط المنظفات الإكسوغليكوزيدازات/الإندوغليكوزيدازات؟ ج: عند مستويات معتدلة (0.5-1.0% من المنظفات الأيونية وغير الأيونية)، تُظهر معظم الغليكوزيدازات نشاطًا مُرضيًا أو لا تتأثر. الاستثناءات هي: PNGase F (جميع التركيبات)، وO-غليكوزيداز، وβ-N-أسيتيل غلوكوزامينيداز، والتي تُثبَّط بواسطة SDS. من الضروري إضافة NP-40 بتركيز نهائي 1% إلى مزيج التفاعل لمواجهة تثبيط المنظفات. يُثبَّط إنزيم Endo D أيضًا بواسطة SDS، ولكن NP-40 لا يُعاكس هذا التثبيط. أخيرًا، يمكن للمواد المُثبِّتة الشائعة، مثل توين، وتريتون X-100، وNP-40، وأوكتيل جلوكوزيد، وسلفوبيتينات غير مُنظِّفة، بالإضافة إلى آثار المذيبات العضوية، أن تمنع عملية إزالة الغليكوزيل السريعة المثلى بواسطة إنزيم Rapid PNGase F. س: لماذا غيّرت إنزيمات NEB Glycosidase محاليل التفاعل؟ ما هي محاليل التفاعل الجديدة، وهل لا يزال بإمكاني استخدام الإنزيم مع محلوله القديم؟ أين يمكنني العثور على تركيبة المحاليل القديمة؟ ج: لتبسيط إجراءات العمل والهضم باستخدام اثنين أو أكثر من إنزيمات exoglycosidase، يتم الآن تزويد معظم الإنزيمات بمحلول GlycoBuffer 1 بتركيز 10X. ويُستثنى من ذلك إنزيمان يتم تزويدهما بمحلول GlycoBuffer 4. كما تم تبسيط مجموعة محاليل الإندوغليكوزيداز. وقد تم تقييم نشاط كل إنزيم من إنزيمات endo- وexoglycosidase في كل من نظام المحلول القديم والجديد. تحتفظ جميع الإنزيمات إما بنفس النشاط، أو وُجد أن نشاطها قد ازداد في المحلول المنظم الجديد. لا تزال بعض الإكسوغليكوزيدازات مزودة بقارورة إضافية من rHSA (يعزز rHSA نشاط بعض الإنزيمات). وكما في السابق، لا تزال بعض الإكسوغليكوزيدازات مزودة بقارورة إضافية من BSA (يعزز BSA نشاط بعض الإنزيمات). ولا تزال المكونات الأخرى (مثل محلول إزالة طبيعة البروتينات السكرية، وNP-40، إلخ) متوفرة عند الحاجة. رقم منتج الإنزيم، المحلول المنظم القديم، المحلول المنظم الحالي، هل تم التغيير؟ إنزيم ألفا-إن-أسيتيل جالاكتوزامينيداز P0734 G7 جليكوبافر 1 نعم، إنزيم ألفا1-2 فوكوسيداز P0724 G4 جليكوبافر 1 نعم، إنزيم ألفا1-2،3،4،6 فوكوسيداز P0748 --- جليكوبافر 1 --- إنزيم ألفا1-2،4،6 فوكوسيداز O p0749 --- جليكوبافر 1 --- إنزيم ألفا1-3،4 فوكوسيداز p0769 --- جليكوبافر 1 --- إنزيم ألفا1-2،3 مانوسيداز P0729 G6 جليكوبافر 1 لا، إنزيم ألفا1-6 مانوسيداز P0727 G2 جليكوبافر 1 نعم، إنزيم ألفا1-2،3،6 مانوسيداز p0768 --- جليكوبافر 4 --- غالاكتوزيداز α1-3,4,6 P0747 --- غليكوبافر 1 ---- غالاكتوزيداز α1-3,6 P0731 G6 غليكوبافر 1 لا نيورامينيداز α2-3 S P0743 --- غليكوبافر 1 --- نيورامينيداز α2-3,6,8 P0720 G1 غليكوبافر 1 نعم نيورامينيداز α2-3,6,8,9 A P0722 --- غليكوبافر 1 --- β-N-أسيتيل هيكسوزامينيداز P0721 G2 غليكوبافر 1 نعم β-N-أسيتيل غلوكوزامينيداز P0732 G1 غليكوبافر 1 نعم β-N-أسيتيل غلوكوزامينيداز S P0744 --- غليكوبافر 1 --- β1-3 جالاكتوزيداز P0726 G6 GlycoBuffer 1 لا β1-4 جالاكتوزيداز S P0745 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3,4 جالاكتوزيداز p0746 --- GlycoBuffer 4 --- N-Glycan Sequencing Kit E0577 --- GlycoBuffer 1 --- Endo S P0741 G6 GlycoBuffer 1 نعم Endo H P0702 G5 GlycoBuffer 3 نعم Endo Hf P0703 G5 GlycoBuffer 3 نعم Endo F2 p0772 --- GlycoBuffer 4 --- Endo F3 p0771 --- GlycoBuffer 4 --- Endo D P0742 G7 GlycoBuffer 2 لا O-Glycosidase P0733 G7 مجموعة GlycoBuffer 2 بدون O-Glycosidase و Neuraminidase E0540 G7 GlycoBuffer 2 بدون Remove-iT® PNGase F P0706 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F P0704 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F (خالي من الجلسرين) P0705 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F، مُعاد التركيب P0708 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F (خالي من الجلسرين)، مُعاد التركيب P0709 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase A p0707 --- Glyco Buffer 3 --- مزيج إزالة الغليكوزيل من البروتين II p6044 --- مزيج إزالة الغليكوزيل Buffer 1 و 2 --- Rapid PNGase F P0710 --- Rapid PNGase F Buffer ---- Rapid™ PNGase F (صيغة غير مُختزلة) p0711 --- محلول منظم سريع لإنزيم PNGase F (صيغة غير مختزلة) س: ما هو الركيزة المناسبة لإنزيم الإندوغليكوزيداز؟ ج: بالنسبة لإنزيم PNGaseF ومزيج إزالة الغليكوزيل من البروتين، نقترح استخدام فيتوين (NEB #P6042، المرفق مع مزيج إزالة الغليكوزيل من البروتين). بالنسبة لإنزيم PNGaseF، وإنزيم Endo H، وإنزيم Endo Hf، نقترح استخدام RNase B (NEB #P7817). بالنسبة لإنزيم Endo D، نقترح استخدام فوسفوليباز A من سم النحل. بالنسبة لإنزيم Endo S، نقترح استخدام IgG أحادي النسيلة من الفأر (NEB #E8032). بالنسبة لإنزيم O-غليكوزيداز، نقترح استخدام p-نيتروفينيل غالاكتو-N-بيوسيد (Galβ1-3GalNAcα1pNP، أو Core1-pNP). بدلاً من ذلك، يمكن هضم فيتوين باستخدام نيورامينيداز، أو نيورامينيداز مع إنزيم O-غليكوزيداز. يمكن ملاحظة التغيرات في الوزن الجزيئي بعد إزالة الجليكان بواسطة SDS-PAGE.