نيو إنجلاند بيولابس، P0709S، PNGase F (خالي من الجلسرين)، مُعاد التركيب

إن إنزيم PNGase F هو الطريقة الإنزيمية الأكثر فعالية لإزالة جميع الفئات ذات الصلة تقريبًا، بما في ذلك: الإندوغليكوزيداز، وتطبيقات تحليل البروتينات، وعلم الجليكوميات وعلم البروتينات السكرية، وأنظمة التعبير، وتسلسل الجليكان، وتعريف وحدة المواصفات . تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لإزالة أكثر من 95% من الكربوهيدرات من 10 ميكروغرام من إنزيم RNase B المنزوع الطبيعة في ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر. محلول مُزيل لطبيعة البروتين السكري 1X، 0.5% SDS، 40 ملي مولار DTT، 1X NP-40، 1% NP-40 في MilliQ-H2O. شروط التفاعل: محلول GlycoBuffer 2 1X، حضانة عند 37 درجة مئوية. محلول GlycoBuffer 2 1X، 50 ملي مولار فوسفات الصوديوم (الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 50 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 20 ملي مولار Tris-HCl، 5 ملي مولار EDTA، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري : 75 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الوزن الجزيئي الظاهري : 36000 دالتون. شروط فحص الوحدة: يتم إزالة طبيعة 10 ميكروغرام من RNase B باستخدام محلول Glycoprotein Denaturing buffer 1X عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد إضافة NP-40 وGlycoBuffer 2، تُضاف تخفيفات متسلسلة من PNGase F (خالي من الجلسرين)، المُعاد تركيبه، ويُحضن مزيج التفاعل لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. تُفحص نواتج التفاعل باستخدام SDS-PAGE. سؤال وجواب : هل يوجد فرق بين PNGase F (P0704/P0705) وPNGase F، المُعاد تركيبه (P0708/P0709)؟ جواب: يُستخلص PNGase F (P0704/P0705) من بكتيريا Elizabethkingia miricola (المعروفة سابقًا باسم Flavobacterium meningosepticum). بينما يُستنسخ PNGase F، المُعاد تركيبه (P0708/P0709) من بكتيريا Elizabethkingia miricola ويُعبَّر عنه في بكتيريا E. coli. لم نرصد أي اختلافات بين النسختين الأصلية والمُعاد تركيبها من PNGase F. تتمتع النسختان من الإنزيم بنفس النشاط والنوعية والتركيز. س: حاولتُ إزالة السكريات من بروتيني السكري باستخدام Remove-iT® PNGase F، لكنني لم ألاحظ إزالة الكربوهيدرات. ما المشكلة؟ ج: هل تعرف كيف ترتبط الكربوهيدرات بالبروتين؟ هل هي مرتبطة برابطة N أم O (مرتبطة بالأسباراجين، أو السيرين/الثريونين)؟ يزيل Remove-iT® PNGase F الكربوهيدرات المرتبطة بالأسباراجين فقط. أما O-Glycosidase من NEB (NEB# P0733) فيزيل الكربوهيدرات المرتبطة بروابط O من النوعين الأساسيين 1 و3 والمرتبطة بالسيرين/الثريونين. إذا لم تلاحظ إزالة السكريات، وكنتَ تعلم أن بروتينك يحتوي على سكريات N، ففكّر في إضافة المزيد من الإنزيم وزيادة مدة الحضانة. إذا اخترتَ تغيير طبيعة البروتين السكري، فتأكد من إضافة NP-40 (لحماية PNGase F المؤتلف من SDS في خطوة تغيير الطبيعة). خارج ظروف التفاعل هذه، قد تكون الكربوهيدرات مقاومة لإنزيم PNGase F المؤتلف (وهو أمر نادر الحدوث). يحدث هذا عندما يتم تعديل N-أسيتيل جلوكوزامين الأساسي بواسطة α1-3Fucose (يوجد غالبًا في بروتينات النباتات والحشرات). س: ماذا يحدث للأسباراجين بعد أن يزيل إنزيم PNGase السكر؟ ج: بما أن الإنزيم هو جليكوأميداز، فإن الأسباراجين يتحول إلى حمض الأسبارتيك. س: لماذا يتحلل البروتين؟ عندما أقوم بتفكيك البروتين وإضافة SDS، لا أرى على هلام SDS-PAGE سوى لطخة أو لا أرى أي بروتين. هل يمكن استخدام مزيج مثبطات البروتياز في تفاعل PNGase F المؤتلف؟ ج: عندما يتم تفكيك البروتين، يصبح أكثر عرضة للتحلل بواسطة البروتيازات. لهذا السبب، يمكن استخدام مزيج من البروتيازات يحتوي على ما يلي في بروتوكول تفاعل PNGase F المُعاد تركيبه: أبروتينين (بتركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل)، بنزاميدين (بتركيز نهائي 1 ملي مولار)، بيبستاتين (بتركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل)، ليوبيبتين (بتركيز نهائي 1 ميكرومولار)، إي جي تي إيه (بتركيز نهائي 1 ملي مولار)، إي دي تي إيه (بتركيز نهائي 1 ملي مولار)، بي إم إس إف (بتركيز نهائي 1 ملي مولار). حضّر محلولًا مركزًا 1000 ضعف لكل مثبط في الماء، باستثناء البيبستاتين الذي يجب إذابته في الميثانول. ملاحظة: يتميز بي إم إس إف بقدرته على تعديل البقايا القاعدية على ركائز البروتينات السكرية. س: ما الفرق بين PNGase F و Endo H و O-Glycosidase؟ ج: يزيل PNGase F جميع أنواع الغلكزة المرتبطة بالنيتروجين (المرتبطة بالأسباراجين)؛ الغلكزة عالية المانوز، والهجينة، والثنائية، والثلاثية، والرباعية التفرع. ستختار هذا الإنزيم إذا كان هدفك هو إزالة جميع الكربوهيدرات المرتبطة بالنيتروجين بغض النظر عن نوعها. يزيل إنزيم Endo H فقط المانوز العالي وبعض الأنواع الهجينة من الكربوهيدرات المرتبطة بالنيتروجين. ستختار هذا الإنزيم لتحديد نوع الارتباط بالجليكوزيل المرتبط بالنيتروجين بدقة أكبر، أو إذا كنت تعلم أن البروتين يحتوي على كربوهيدرات حساسة لإنزيم Endo H. سيزيل إنزيم O-Glycosidase من شركة NEB ثنائيات السكاريد المرتبطة بالنيتروجين من النوعين 1 و3 منزوعة حمض السياليك والمرتبطة ببقايا سيرين/ثريونين. س: هل يعمل إنزيم PNGase F في اليوريا؟ ج: إنزيم PNGase F مستقر في اليوريا بتركيز 2.5 مولار عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة، ولا يزال يحتفظ بنسبة 40% من نشاطه في اليوريا بتركيز 5 مولار. 1. Maley, F., et al, Anal Biochem, 180, 195-204 (1989) س: ما هي ظروف التفاعل النموذجية لإنزيم PNGase F المؤتلف؟ أ: ظروف التفاعل النموذجية هي كما يلي: يجب تحديد أوقات الحضانة المثلى وتركيزات الإنزيم تجريبيًا لكل ركيزة. امزج 1-20 ميكروغرام من البروتين السكري، و1 ميكرولتر من محلول التحلل البروتيني السكري 10X، والماء (إذا لزم الأمر) لتكوين حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر. قم بتفكيك البروتين السكري بتسخين التفاعل عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. حضّر حجم تفاعل إجمالي قدره 20 ميكرولتر بإضافة 2 ميكرولتر من محلول التحلل البروتيني السكري 10X، و2 ميكرولتر من NP40 بتركيز 10%، والماء، و1-5 ميكرولتر من إنزيم PNGase F المؤتلف. حضّن التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ملاحظة: يمكن زيادة حجم التفاعلات خطيًا لاستيعاب أحجام تفاعل أكبر. س: ما هي كمية إنزيم PNGase F المُعاد تركيبه التي يجب استخدامها لإزالة الكربوهيدرات في الظروف الطبيعية أو ظروف التمسخ باستخدام DTT؟ ج: عندما لا يتم تمسخ البروتين باستخدام SDS، يبذل إنزيم PNGase F المُعاد تركيبه جهدًا أكبر للوصول إلى موقع انقسام الكربوهيدرات (بسبب البنية الثانوية والثالثية للبروتين). في بعض الأحيان، قد يساعد استخدام كمية إضافية من الإنزيم أو تمديد فترة الحضانة، ولكن هذه القيم خاصة بكل بروتين ويجب تحديدها تجريبيًا. س: كيف يمكنني تثبيط إنزيم PNGase F المُعاد تركيبه؟ ج: يُعد SDS مثبطًا ممتازًا لإنزيم PNGase F المُعاد تركيبه. س: هل يتوافق إنزيم PNGase F المُعاد تركيبه مع التحليلات اللاحقة مثل HPLC وقياس الطيف الكتلي؟ ج: تُوفر شركة NEB نوعين من الإنزيم، وهما: PNGase F المُعاد تركيبه (NEB #P0708) وPNGase F المُعاد تركيبه (الخالي من الجلسرين) (NEB #P0709). يتمتع كلا النوعين من الإنزيم بنفس النشاط والنوعية والتركيز. الفرق الوحيد بينهما هو أن إنزيم PNGase F المُعاد تركيبه يُخزن في محلول جلسرين بنسبة 50%، بينما إنزيم PNGase F المُعاد تركيبه الخالي من الجلسرين لا يحتوي على الجلسرين في محلول التخزين الخاص به. يُوصى باستخدام إنزيم PNGase F المُعاد تركيبه الخالي من الجلسرين عند إجراء تحليل لاحق باستخدام كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء (HPLC) و/أو مطياف الكتلة، نظرًا لعدم تحمل هذه الأجهزة للجلسرين. لا يتوافق محلول إزالة طبيعة البروتينات السكرية (الذي يحتوي على SDS وDTT) مع تطبيقات مطياف الكتلة، وغالبًا ما يصعب إزالته من التفاعل. لذلك، نوصي باستخدام إنزيم PNGase F المُعاد تركيبه الخالي من الجلسرين في ظروف غير مُسببة لإزالة الطبيعة إذا كان سيتم استخدام HPLC أو MS للتحليل اللاحق. تتطلب الظروف غير المُسببة لإزالة الطبيعة عادةً وحدات إنزيمية أكثر وفترة حضانة أطول. س: ما هي الجليكوزيدازات وما استخداماتها؟ ج: تُستخدم الجليكوسيدازات للحصول على معلومات حول مجموعات الكربوهيدرات المرتبطة بالبروتينات السكرية والببتيدات السكرية. وهي نوعان: إندوجليكوسيدازات التي تفصل مجموعات الكربوهيدرات بالكامل عن البروتينات، وإكسوجليكوسيدازات التي تزيل السكريات الأحادية من النهايات غير المختزلة للكربوهيدرات. أما النهاية المختزلة فهي تلك التي يُنتجها الإندوجليكوسيداز. غالبًا ما يستخدم الباحثون إندوجليكوسيداز متبوعًا بواحد أو أكثر من الإكسوجليكوسيدازات، ثم يحللون النواتج باستخدام SDS-PAGE أو أنواع مختلفة من الكروماتوغرافيا السائلة. س: هل تُثبط المنظفات الإكسوجليكوسيدازات/الإندوجليكوسيدازات؟ ج: عند مستويات معتدلة (0.5-1.0% من المنظفات الأيونية وغير الأيونية)، تُظهر معظم الجليكوسيدازات نشاطًا مُرضيًا أو لا تتأثر. باستثناءاتٍ مثل: إنزيم PNGase F (بجميع تركيباته)، وإنزيم O-جليكوسيداز، وإنزيم β-N-أسيتيل جلوكوزامينيداز، والتي يُثبَّط عملها بواسطة SDS. من الضروري إضافة NP-40 بتركيز نهائي 1% إلى مزيج التفاعل لمعادلة تثبيط المنظفات. يُثبَّط إنزيم Endo D أيضًا بواسطة SDS، ولكن NP-40 لا يُعادل هذا التثبيط. أخيرًا، يمكن للمواد المُثبِّتة الشائعة مثل Tween وTriton X-100 وNP-40 وأوكتيل جلوكوزيد وسلفوبيتينات غير مُنظِّفة، بالإضافة إلى آثار المذيبات العضوية، أن تمنع عملية إزالة الجليكوزيل السريعة المثلى بواسطة إنزيم Rapid PNGase F. س: لماذا غيَّرت إنزيمات NEB Glycosidase محاليل التفاعل؟ ما هي محاليل التفاعل الجديدة، وهل يُمكنني استخدام الإنزيم مع محلوله القديم؟ أين يُمكنني العثور على تركيبة المحاليل القديمة؟ ج: لتبسيط سير العمل وعمليات الهضم باستخدام اثنين أو أكثر من الإكسوغليكوزيدازات، تُزوَّد معظم الإنزيمات الآن بمحلول غليكوبفر 1 بتركيز 10X. ويُستثنى من ذلك إنزيمان يُزوَّدان بمحلول غليكوبفر 4. كما تم تبسيط مجموعة المحاليل المنظمة للإندوغليكوزيدازات. وقد تم تقييم نشاط كل إنزيم من الإندوغليكوزيدازات والإكسوغليكوزيدازات في كلٍّ من نظام المحلول المنظم القديم والجديد. احتفظت جميع الإنزيمات إما بنفس النشاط، أو وُجد أن نشاطها أكبر في المحلول المنظم الجديد. لا تزال بعض الإكسوغليكوزيدازات تُزوَّد بقارورة إضافية من rHSA (يعزز rHSA نشاط بعض الإنزيمات). وكما كان الحال سابقًا، لا تزال بعض الإكسوغليكوزيدازات تُزوَّد بقارورة إضافية من BSA (يعزز BSA نشاط بعض الإنزيمات). ولا تزال المكونات الأخرى (مثل محلول تمسخ البروتين السكري، وNP-40، وما إلى ذلك) متوفرة عند الحاجة. رقم منتج الإنزيم، المحلول المنظم القديم، المحلول المنظم الحالي، هل تم التغيير؟ إنزيم ألفا-إن-أسيتيل جالاكتوزامينيداز P0734 G7 جليكوبافر 1 نعم، إنزيم ألفا1-2 فوكوسيداز P0724 G4 جليكوبافر 1 نعم، إنزيم ألفا1-2،3،4،6 فوكوسيداز P0748 --- جليكوبافر 1 --- إنزيم ألفا1-2،4،6 فوكوسيداز O p0749 --- جليكوبافر 1 --- إنزيم ألفا1-3،4 فوكوسيداز p0769 --- جليكوبافر 1 --- إنزيم ألفا1-2،3 مانوسيداز P0729 G6 جليكوبافر 1 لا، إنزيم ألفا1-6 مانوسيداز P0727 G2 جليكوبافر 1 نعم، إنزيم ألفا1-2،3،6 مانوسيداز p0768 --- جليكوبافر 4 --- غالاكتوزيداز α1-3,4,6 P0747 --- غليكوبافر 1 ---- غالاكتوزيداز α1-3,6 P0731 G6 غليكوبافر 1 لا نيورامينيداز α2-3 S P0743 --- غليكوبافر 1 --- نيورامينيداز α2-3,6,8 P0720 G1 غليكوبافر 1 نعم نيورامينيداز α2-3,6,8,9 A P0722 --- غليكوبافر 1 --- β-N-أسيتيل هيكسوزامينيداز P0721 G2 غليكوبافر 1 نعم β-N-أسيتيل غلوكوزامينيداز P0732 G1 غليكوبافر 1 نعم β-N-أسيتيل غلوكوزامينيداز S P0744 --- غليكوبافر 1 --- β1-3 جالاكتوزيداز P0726 G6 GlycoBuffer 1 لا β1-4 جالاكتوزيداز S P0745 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3,4 جالاكتوزيداز p0746 --- GlycoBuffer 4 --- N-Glycan Sequencing Kit E0577 --- GlycoBuffer 1 --- Endo S P0741 G6 GlycoBuffer 1 نعم Endo H P0702 G5 GlycoBuffer 3 نعم Endo Hf P0703 G5 GlycoBuffer 3 نعم Endo F2 p0772 --- GlycoBuffer 4 --- Endo F3 p0771 --- GlycoBuffer 4 --- Endo D P0742 G7 GlycoBuffer 2 لا O-Glycosidase P0733 G7 مجموعة GlycoBuffer 2 بدون O-Glycosidase و Neuraminidase E0540 G7 GlycoBuffer 2 بدون Remove-iT® PNGase F P0706 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F P0704 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F (خالي من الجلسرين) P0705 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F، مُعاد التركيب P0708 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F (خالي من الجلسرين)، مُعاد التركيب P0709 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase A p0707 --- Glyco Buffer 3 --- مزيج إزالة الغليكوزيل من البروتين II p6044 --- مزيج إزالة الغليكوزيل Buffer 1 و 2 --- Rapid PNGase F P0710 --- Rapid PNGase F Buffer ---- Rapid™ PNGase F (صيغة غير مُختزلة) p0711 --- محلول منظم سريع لإنزيم PNGase F (صيغة غير مختزلة) س: ما هو الركيزة المناسبة لإنزيم الإندوغليكوزيداز؟ ج: بالنسبة لإنزيم PNGaseF ومزيج إزالة الغليكوزيل من البروتين، نقترح استخدام فيتوين (NEB #P6042، المرفق مع مزيج إزالة الغليكوزيل من البروتين). بالنسبة لإنزيم PNGaseF، وإنزيم Endo H، وإنزيم Endo Hf، نقترح استخدام RNase B (NEB #P7817). بالنسبة لإنزيم Endo D، نقترح استخدام فوسفوليباز A من سم النحل. بالنسبة لإنزيم Endo S، نقترح استخدام IgG أحادي النسيلة من الفأر (NEB #E8032). بالنسبة لإنزيم O-غليكوزيداز، نقترح استخدام p-نيتروفينيل غالاكتو-N-بيوسيد (Galβ1-3GalNAcα1pNP، أو Core1-pNP). بدلاً من ذلك، يمكن هضم فيتوين باستخدام نيورامينيداز، أو نيورامينيداز مع إنزيم O-غليكوزيداز. يمكن ملاحظة التغيرات في الوزن الجزيئي بعد إزالة الجليكان بواسطة SDS-PAGE.