نيو إنجلاند بيولابس، P0710S، رابيد™ PNGase F

يُمكّن إنزيم PNGase F السريع من إزالة الغليكوزيل بشكل كامل وسريع من الأجسام المضادة وبروتينات الاندماج المناعي، بالإضافة إلى البروتينات السكرية الأخرى، في غضون دقائق. جميع الفئات ذات الصلة : إنزيمات التحلل الداخلي، تطبيقات تحليل البروتينات، العلاجات الحيوية وتحليل الأجسام المضادة، أنظمة التعبير، تسلسل الغليكان، تحديد شروط التفاعل : محلول منظم لإنزيم PNGase F السريع بتركيز 1X، يُحضن عند 50 درجة مئوية، التعطيل الحراري عند 75 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الأسئلة الشائعة : س: ما الفرق بين إنزيم PNGase F السريع وإنزيم Endo S (Endo S، NEB# P0741)؟ ج: يقوم إنزيم PNGase F السريع بفصل الغليكان المرتبط بالنيتروجين من الأجسام المضادة بين بقايا GlcNAc والأسباراجين الداخلية. أما إنزيم Endo S فهو إنزيم تحلل داخلي يقوم بفصل الغليكان المرتبط بالنيتروجين من السلسلة الثقيلة لبروتين IgG الأصلي داخل لب الكيتوبيوز. تبقى جزيئة واحدة من N-أسيتيل جلوكوزامين (GlcNAc)، مع بقايا الفوكوز إن وجدت، مرتبطة ببقايا الأسباراجين في سلسلة IgG. س: ما الفرق بين Rapid PNGase F و PNGase F؟ ج: تم تطوير Rapid PNGase F لإزالة الغليكوزيل من الأجسام المضادة والبروتينات الاندماجية ذات الصلة في دقائق. إن سهولة إعداد التفاعل وسرعة وقت التفاعل يجعلان Rapid PNGase F مثاليًا للتطبيقات عالية الإنتاجية أثناء تطوير ومراقبة جودة الأجسام المضادة وحيدة النسيلة العلاجية. س: ما هي مكونات Rapid PNGase F؟ ج: يأتي Rapid PNGase F مزودًا بمحلول Rapid PNGase F Buffer الخاص به بتركيز 5x. س: ما هي ظروف التفاعل النموذجية لـ Rapid PNGase F؟ ج: لتحقيق نقل حراري مثالي، استخدم أنابيب دقيقة رقيقة الجدران سعة 0.2 مل، أو بدلاً من ذلك، أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مل. يُعد جهاز التدوير الحراري ذو الغطاء المُسخّن، أو كتلة تسخين الأنابيب الدقيقة، مناسبًا للحضانة. يمكن زيادة حجم التفاعلات بشكل خطي لاستيعاب كميات أكبر من البروتين السكري و/أو أحجام تفاعل أكبر. بروتوكول الخطوة الواحدة: امزج ما يصل إلى 100 ميكروغرام من الجسم المضاد مع الماء حتى يصل الحجم إلى 16 ميكرولتر. أضف 4 ميكرولتر من محلول Rapid PNGase F بتركيز 5X ليصل حجم التفاعل الكلي إلى 20 ميكرولتر. أضف 1 ميكرولتر من إنزيم Rapid PNGase F. حضّن المزيج لمدة 10 دقائق عند 50 درجة مئوية. حضّر جزيئات N-جليكان للاشتقاق (أي الأَمْيَنَة الاختزالية) لتحليلها لاحقًا. لتحضير بروتين منزوع الغليكوزيل لتحليله باستخدام مطياف الكتلة، استبدل المحلول المنظم بواسطة الميكرودياليز أو الترشيح الدقيق. راجع قسم "علم البروتينات السكرية: بروتوكولات استبدال المحلول المنظم" لمزيد من التفاصيل. بروتوكول الخطوتين: تتطلب بعض الأجسام المضادة (مثل جزيئات Fab N-جليكان) خطوة تسخين مسبق لإزالة الغليكوزيل بكفاءة. امزج ما يصل إلى 100 ميكروغرام من الجسم المضاد مع الماء حتى يصل الحجم إلى 16 ميكرولتر. أضف 4 ميكرولتر من محلول Rapid PNGase F بتركيز 5X ليصل حجم التفاعل الكلي إلى 20 ميكرولتر. حضّن المزيج عند 80 درجة مئوية لمدة دقيقتين، ثم اتركه ليبرد. أضف 1 ميكرولتر من Rapid PNGase F. حضّن المزيج لمدة 10 دقائق عند 50 درجة مئوية. حضّر جزيئات N-جليكان للاشتقاق (أي الأَمْيَنَة الاختزالية) لتحليلها لاحقًا. لتحضير بروتين منزوع الغليكوزيل لتحليله باستخدام مطياف الكتلة، استبدل المحلول المنظم باستخدام الميكرودياليز أو الترشيح الدقيق. راجع قسم "علم البروتينات السكرية: بروتوكولات استبدال المحلول المنظم" لمزيد من التفاصيل. س: كيف أعرف ما إذا كان عليّ اتباع بروتوكول "الخطوة الواحدة" أو "الخطوتين"؟ ج: طُوّر Rapid PNGase F لإزالة الغليكوزيل من الأجسام المضادة بكفاءة وسرعة في تفاعل بسيط من خطوة واحدة عند 50 درجة مئوية. مع ذلك، تتطلب بعض الأجسام المضادة IgG (أي التي تحمل غليكوزيل Fab) خطوة تسخين مسبق لمدة دقيقتين عند 80 درجة مئوية. نوصي بالبدء ببروتوكول الخطوة الواحدة القياسي. إذا توفرت أدلة (مثلًا من خلال تحليل الهجرة الهلامية أو التحليل البروتيني) على بقاء جزيئات N-جليكان مرتبطة بالبروتين، فاتبع بروتوكول الخطوتين. س: ما كمية إنزيم Rapid PNGase F التي يجب استخدامها لإزالة جزيئات N-جليكان من عينة الأجسام المضادة؟ ج: كمية الإنزيم الموصى بها كافية لإزالة جزيئات N-جليكان من ما يصل إلى 100 ميكروغرام من جسم مضاد أحادي النسيلة من الفأر من النمط IgG2a. سيتم تحديد الكمية المثلى للمادة الأولية بناءً على طبيعة العينة (تنوع جزيئات الجليكان) وتحليل N-جليكان اللاحق المحدد الذي سيتم إجراؤه. عادةً، 30-50 ميكروغرام من الجسم المضاد كافية للقياس الكمي الكامل لجزيئات N-جليكان (بعد الوسم بالأمينة الاختزالية) بواسطة HILIC متبوعًا بـ ESI-MS. بالنسبة للبروتينات التي تحتوي على مواقع جليكان إضافية، و/أو تباين عالٍ في الجليكان، قد يلزم المزيد من المادة الأولية لقياس جميع أنواع الجليكان الثانوية. يمكن زيادة حجم التفاعلات خطيًا لاستيعاب كميات أكبر من البروتين السكري و/أو أحجام تفاعل أكبر. س: ما هي المحاليل المنظمة أو الإضافات التي يجب تجنبها عند استخدام إنزيم PNGase F السريع؟ ج: يجب أن يكون البروتين المستهدف في محلول متوافق مع نشاط إنزيم PNGase F السريع. تجنب المحاليل المنظمة التي تحتوي على SDS، لأنها تثبط إنزيم PNGase F. يمكن أن تمنع عوامل التثبيت الشائعة مثل توين، وتريتون X-100، وNP-40، وأوكتيل جلوكوزيد، وسلفوبيتينات غير منظفة، بالإضافة إلى آثار المذيبات العضوية، عملية إزالة الغليكوزيل السريعة المثلى. س: كيف يمكنني اختبار اكتمال تفاعل إنزيم PNGase F السريع خلال 10 دقائق؟ ج: بالنسبة للأجسام المضادة وحيدة النسيلة، يمكن ملاحظة تغير في SDS-PAGE بعد إزالة N-غليكان. عادةً ما يكون هذا التغيير طفيفًا، لذا من الضروري إجراء اختبار تحكم بالتزامن مع العينة الأصلية لمقارنة الموقع على الهلام، وتحديد ما إذا كانت إزالة الغليكوزيل جزئية أم كاملة (راجع بروتوكول "تحليل تفاعل إزالة الغليكوزيل السريع باستخدام إنزيم PNGase F بواسطة SDS-PAGE"). للكشف عما إذا كانت كميات ضئيلة من الأجسام المضادة المُغلْكَزة لا تزال موجودة، يلزم إجراء اختبار أكثر حساسية. على سبيل المثال، سيُظهر التحليل البروتيني باستخدام LS-ESI-TOF الأشكال المختلفة المُغلْكَزة وغير المُغلْكَزة الموجودة (راجع بروتوكول "البروتين السليم باستخدام LS-ESI-TOF"). س: هل التحليلات اللاحقة مثل HPLC وقياس الطيف الكتلي متوافقة مع إنزيم PNGase F السريع؟ ج: نعم، لتحضير العينات للكروماتوغرافيا السائلة و/أو قياس الطيف الكتلي، يمكن عزل N-غليكانات باستخدام طرق الاستخلاص التقليدية في الطور الصلب مثل C18 والكربون المُجرافن (PGC). راجع "بروتوكولات استخلاص الغليكان باستخدام C18 والكربون المُجرافيت". بالإضافة إلى C18 وPGC، يمكن استخدام التفاعل المحب للماء (HILIC) في المراحل اللاحقة. في تجارب البروتينات، يمكن تحضير الجسم المضاد المستهدف باستخدام الغسيل الكلوي الدقيق أو الترشيح الدقيق (راجع "بروتوكولات تبادل المحلول في علم البروتينات السكرية"). س: هل إنزيم Rapid PNGase F مناسب فقط لإزالة الغليكوزيل من الأجسام المضادة؟ ج: على الرغم من أن هذا المنتج مُحسَّن لإزالة الغليكانات المرتبطة بالنيتروجين من الأجسام المضادة بسرعة، إلا أنه يمكن استخدامه مع العديد من البروتينات السكرية الأخرى. وقد ثبت أن إنزيم Rapid PNGase F يعمل على بروتينات أخرى مثل الفيبرينوجين والترانسفيرين. مع ذلك، لم تتم إزالة الغليكوزيل من بعض البروتينات التي تم اختبارها، مثل الفيوتين، بكفاءة باستخدام إنزيم Rapid PNGase F خلال 10 دقائق. س: هل تؤثر فترات الحضانة الطويلة سلبًا على تفاعل إنزيم Rapid PNGase F؟ ج: لا. تم الحصول على نتائج متطابقة (كمية ونوعية الغليكانات المرتبطة بالنيتروجين المُحررة، بالإضافة إلى تحليل سليم للأجسام المضادة منزوعة الغليكوزيل) بعد فترة حضانة لمدة 10 دقائق أو ساعة واحدة. س: ما هو نطاق درجة حرارة التفاعل لإنزيم Rapid PNGase F؟ ج: باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة من الفأر، لوحظت إزالة فعالة للغليكوزيل في غضون 10 دقائق عند درجة حرارة تتراوح من 48 إلى 58 درجة مئوية. درجة الحرارة المثلى لاستخدام إنزيم Rapid PNGase F هي 50 درجة مئوية. س: ماذا يحدث لبقايا الأسباراجين بعد أن يزيل إنزيم Rapid PNGase F السكر؟ ج: بما أن الإنزيم هو غليكوأميداز، فإن بقايا الأسباراجين تتحول إلى حمض الأسبارتيك. س: هل يحافظ تفاعل إنزيم Rapid PNGase F على سلامة الغليكوزيلامينات؟ ج: لا. على الرغم من أن إنزيم Rapid PNGase F يُحرر الغليكانات المرتبطة بالنيتروجين على شكل غليكوزيلامينات، إلا أن مجموعة الأمين غير مستقرة وتتحول بسرعة. ينتج عن تفاعل إزالة الغليكوزيل غليكانات N ذات طرف مختزل حر. س: هل يمكن استخدام مزيج مثبطات البروتياز في تفاعل Rapid PNGase F؟ ج: نعم. مزيج مثبطات البروتياز متوافق مع تفاعل Rapid PNGase F. تم اختبار مثبطات البروتياز التالية: أبروتينين (بتركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل)، بنزاميدين (بتركيز نهائي 1 ملي مولار)، بيبستاتين (بتركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل)، ليوبيبتين (بتركيز نهائي 1 ميكرومولار)، EGTA (بتركيز نهائي 1 ملي مولار)، EDTA (بتركيز نهائي 1 ملي مولار)، وPMSF (بتركيز نهائي 1 ملي مولار). يُرجى ملاحظة أننا لا نوصي باستخدام PMSF لقدرته على تعديل البقايا القاعدية على ركائز البروتين السكري. س: ما هي ركيزة التحكم الجيدة لتفاعل Rapid PNGase F؟ ج: معيار الأجسام المضادة لتفاعل Rapid PNGase F، NEB #P6043. المعيار السريع للأجسام المضادة PNGase F هو جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد لـ MBP من الفئران، من النوع IgG2a.