نيو إنجلاند بيولابس، P0711S، Rapid™ PNGase F (صيغة غير مختزلة)

الفئات ذات الصلة: الإندوغليكوزيداز، تطبيقات تحليل البروتينات، العلاجات الحيوية وتحليل الأجسام المضادة، أنظمة التعبير، علم البروتينات، مواصفات ظروف التفاعل : محلول منظم Rapid PNGase F (غير مختزل) 1X، حضانة عند 50 درجة مئوية، محلول التخزين: 20 ملي مولار Tris-HCl، 50 ملي مولار NaCl، 5 ملي مولار EDTA، درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية ، تعطيل حراري عند 75 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الأسئلة الشائعة : س: ما الفرق بين Rapid PNGase F وRapid PNGase F (غير مختزل)؟ ج: تحافظ ظروف تفاعل Rapid PNGase F (غير مختزل) على سلامة روابط ثنائي الكبريتيد، مما يجعله الكاشف المفضل لدراسات مطياف الكتلة للبروتينات متعددة الوحدات غير المُغلْكَزة السليمة (مثل الأجسام المضادة). بينما يُعد Rapid PNGase F (NEB #P0710) مثاليًا لتحليل N-غليكان وتطبيقات تحديد خصائصه. بالإضافة إلى ذلك، يتبع إنزيم Rapid PNGase F (الصيغة غير المختزلة) بروتوكولًا من خطوتين، نظرًا لمتطلباته الصارمة المتمثلة في حضانة مسبقة عند 75 درجة مئوية. س: ما الفرق بين إنزيم Rapid PNGase F (الصيغة غير المختزلة) وإنزيم Endo S (Endo S، NEB# P0741)؟ ج: يقوم إنزيم Rapid PNGase F (الصيغة غير المختزلة) بفصل جزيئات N-جليكان من الأجسام المضادة بين بقايا GlcNAc الداخلية وبقايا الأسباراجين. أما إنزيم Endo S فهو إنزيم داخلي لفصل جزيئات N-جليكان من السلسلة الثقيلة لـ IgG الأصلي، وذلك من خلال فصل نواة الكيتوبيوز. مع إنزيم Endo S، تبقى جزيئة GlcNAc واحدة، مع بقايا الفوكوز إن وجدت، مرتبطة ببقايا الأسباراجين في سلسلة IgG. س: ما هي مكونات إنزيم Rapid PNGase F (الصيغة غير المختزلة)؟ ج: يُزوَّد إنزيم Rapid PNGase F (بصيغة غير مُختزِلة) بمحلول منظم خاص به بتركيز 5X (NEB# B0717S) لإزالة الغليكوزيل بسرعة في ظروف غير مُختزِلة. س: ما هي كمية عينة الأجسام المضادة التي يُمكن إزالة الغليكوزيل منها باستخدام إنزيم Rapid PNGase F (بصيغة غير مُختزِلة)؟ ج: يُعدّ 1 ميكرولتر من إنزيم Rapid PNGase F (بصيغة غير مُختزِلة) في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر هو الأمثل لإزالة الغليكوزيل بسرعة لما يصل إلى 10 ميكروغرام من الأجسام المضادة التي تحتوي على غليكوزيل Fc وFab (مثل سيتوكسيماب)، و15 ميكروغرام من جسم مضاد أحادي النسيلة من الفأر من النمط IgG2a، و30 ميكروغرام من الأجسام المضادة الأقل تعقيدًا، مثل ريتوكسيماب. يُمكن زيادة حجم التفاعلات خطيًا لاستيعاب كميات أكبر من الأجسام المضادة و/أو البروتينات السكرية. س: ما هي الركيزة الضابطة المناسبة لإنزيم Rapid PNGase F؟ ج: معيار الأجسام المضادة لإنزيم Rapid PNGase F، رقم NEB: P6043. معيار الأجسام المضادة لإنزيم Rapid PNGase F هو جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد لبروتين المايلين القاعدي (MBP) من الفئران، من النمط IgG2a. س: ماذا أفعل إذا تمت إزالة الغليكوزيل من البروتين المستهدف جزئيًا فقط باستخدام إنزيم Rapid PNGase F (الصيغة غير المختزلة)؟ ج: يمكن زيادة كمية محلول إنزيم Rapid PNGase F (الصيغة غير المختزلة) حتى 4 ميكرولتر في حجم إجمالي قدره 10 ميكرولتر لتسهيل إزالة الغليكان في الركائز المعقدة. بالنسبة لبعض البروتينات (على سبيل المثال، الفيوتين أو موجهة الغدد التناسلية المشيمية)، تُعد العوامل المختزلة ضرورية للغاية، ولن تكون إزالة الغليكوزيل السريعة الكاملة ممكنة في ظل ظروف غير مختزلة. في مثل هذه الحالات، نوصي باستخدام إنزيم Rapid PNGase F (رقم NEB: P0710). س: ما هي المحاليل المنظمة أو الإضافات التي يجب تجنبها عند استخدام إنزيم PNGase F السريع (الصيغة غير المختزلة)؟ ج: يجب أن يكون البروتين المستهدف في محلول متوافق مع نشاط إنزيم PNGase F السريع (الصيغة غير المختزلة). تجنب المحاليل المنظمة التي تحتوي على SDS، لأنها تثبط جميع أنواع إنزيم PNGase F. يمكن أن تمنع عوامل التثبيت الشائعة مثل توين، وتريتون X-100، وNP-40، وأوكتيل جلوكوزيد، وسلفوبيتينات غير منظفة، بالإضافة إلى آثار المذيبات العضوية، عملية إزالة الغليكوزيل السريعة المثلى. س: كيف يمكنني اختبار اكتمال تفاعل إنزيم PNGase F السريع (الصيغة غير المختزلة) خلال 10 دقائق؟ ج: بالنسبة للأجسام المضادة وحيدة النسيلة، يمكن ملاحظة تغير في SDS-PAGE بعد إزالة N-غليكان. عادةً، يكون هذا التغيير طفيفًا، لذا من الضروري إجراء اختبار تحكم مع العينة الفعلية لمقارنة الموضع على الهلام، وتحديد ما إذا كانت إزالة الغليكوزيل جزئية أم كاملة (راجع بروتوكول "SDS-PAGE"). للكشف عما إذا كانت كميات ضئيلة من الأجسام المضادة المُغلْكَزة لا تزال موجودة، يلزم إجراء اختبار أكثر حساسية. على سبيل المثال، سيُظهر التحليل البروتيني بواسطة LS-ESI-TOF الأشكال المختلفة المُغلْكَزة وغير المُغلْكَزة الموجودة. س: هل إنزيم Rapid PNGase F (الصيغة غير المُختزِلة) متوافق مع تحليل مطياف الكتلة اللاحق؟ ج: نعم، لتحضير العينات لمطياف الكتلة، يمكن تحضير البروتين المستهدف باستخدام الغسيل الكلوي الدقيق أو الترشيح الدقيق (راجع "علم البروتينات السكرية: بروتوكولات تبادل المحلول"). س: هل إنزيم Rapid PNGase F (الصيغة غير المُختزِلة) مناسب فقط لإزالة الغليكوزيل من الأجسام المضادة؟ ج: على الرغم من أن هذا المنتج مُحسَّن لإزالة N-جليكانات بسرعة من الأجسام المضادة، إلا أنه يُمكن استخدامه مع العديد من البروتينات السكرية الأخرى. وقد ثبت أن إنزيم Rapid PNGase F (الصيغة غير المُختزلة) يعمل على بروتينات أخرى مثل الفيبرينوجين والترانسفيرين. مع ذلك، لم تتم إزالة السكريات بكفاءة من بعض البروتينات التي تم اختبارها، مثل الفيوتين، باستخدام إنزيم Rapid PNGase F (الصيغة غير المُختزلة) خلال 10 دقائق. س: هل فترات الحضانة الأطول ضارة بتفاعل إنزيم Rapid PNGase F (الصيغة غير المُختزلة)؟ ج: لا. تم الحصول على نتائج مُطابقة (كمية ونوعية السكريات N-جليكانات المُحررة، بالإضافة إلى تحليل سليم للجسم المضاد المُزال منه السكريات) بعد فترة حضانة لمدة 10 دقائق أو ساعة واحدة. س: ما هو نطاق درجة حرارة التفاعل لإنزيم Rapid PNGase F (الصيغة غير المُختزلة)؟ ج: باستخدام معيار الأجسام المضادة Rapid PNGase F (NEB #P6043)، وهو جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد لبروتين المايلين القاعدي (MBP) من الفئران، من النمط IgG2a، لوحظت إزالة فعالة للسكريات خلال 10 دقائق عند درجة حرارة تتراوح بين 48 و58 درجة مئوية. درجة الحرارة المثلى لاستخدام Rapid PNGase F (الصيغة غير المختزلة) هي 50 درجة مئوية. س: ماذا يحدث لبقايا الأسباراجين بعد أن يزيل Rapid PNGase F السكر؟ ج: بما أن الإنزيم هو جليكوأميداز، فإن بقايا الأسباراجين تتحول إلى حمض الأسبارتيك. س: هل يمكن استخدام مزيج مثبطات البروتياز في تفاعل Rapid PNGase F (الصيغة غير المختزلة)؟ ج: نعم. مزيج مثبطات البروتياز متوافق مع تفاعل Rapid PNGase F (الصيغة غير المختزلة). تم اختبار مثبطات البروتياز التالية: أبروتينين (بتركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل)، بنزاميدين (بتركيز نهائي 1 ملي مولار)، بيبستاتين (بتركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل)، ليوبيبتين (بتركيز نهائي 1 ميكرومولار)، إي جي تي إيه (بتركيز نهائي 1 ملي مولار)، إي دي تي إيه (بتركيز نهائي 1 ملي مولار)، و بي إم إس إف (بتركيز نهائي 1 ملي مولار). يُرجى ملاحظة أننا لا نوصي باستخدام بي إم إس إف لقدرته على تعديل البقايا القاعدية على ركائز البروتين السكري. س: هل تفاعل Rapid PNGase F (الصيغة غير المختزلة) متوافق مع تريبسين-ألترا™ (NEB# P8101)؟ ج: نعم، يمكن إضافة تريبسين-ألترا™ من نوع قياس الطيف الكتلي (NEB# P8101) مباشرةً إلى العينات المهضومة باستخدام Rapid PNGase F (الصيغة غير المختزلة). البروتوكول: أضف 200 ميكروغرام من إنزيم التربسين فائق النقاء (درجة نقاء مطياف الكتلة NEB# P8101) إلى 10 ميكرولتر من تفاعل إنزيم PNGase F السريع (غير المختزل) الذي يحتوي على 10 ميكروغرام من الأجسام المضادة، وذلك للحصول على نسبة تربسين/أجسام مضادة 1:50. حضّن المزيج عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعتين (ملاحظة: قد تتطلب الركائز المختلفة كميات مختلفة من التربسين، وأوقات حضانة مُحسّنة). يُوصى باستخدام طرق الاستخلاص المحبة للماء لعزل الببتيدات بعد تفاعل إنزيم PNGase F السريع (غير المختزل)/التربسين.