نيو إنجلاند بيولابس، P0720S، نيورامينيداز α2-3,6,8

الفئات ذات الصلة : الإكسوغليكوزيداز، تطبيقات تحليل البروتينات، أنظمة التعبير، تسلسل الغليكان، علم البروتينات، تعريف وحدة المواصفات : تُعرف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لفصل أكثر من 95% من α-Neu5Ac الطرفي من 1 نانومول من Neu5Acα2-3Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc-7-amino-4-methyl-coumarin (AMC)، في 5 دقائق عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول جليكوبازر 1 بتركيز 1X، حضانة عند 37 درجة مئوية. محلول جليكوبازر 1 بتركيز 1X، 5 ملي مولار كلوريد الكالسيوم، 50 ملي مولار أسيتات الصوديوم (الأس الهيدروجيني 5.5 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين : 50 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 20 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 5 ملي مولار إيديتات ثنائي الصوديوم (الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية) . التثبيط الحراري : 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الوزن الجزيئي الظاهري : 43 كيلو دالتون. شروط فحص الوحدة : يتم تحضين تخفيفات متسلسلة من إنزيم نيورامينيداز α2-3,6,8 مع 1 نانومول من الركيزة الموسومة بـ AMC ومحلول جليكوبازر 1 بتركيز 1X في تفاعل حجمه 10 ميكرولتر. يتم تحضين مزيج التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. يتم تصوير فصل نواتج التفاعل باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (3). الأسئلة الشائعة: س: هل يمكنني استخدام إنزيم نيورامينيداز α2-3,6,8 في عملية هضم مزدوجة مع إنزيم Endo H(Hf) أو PNGase F؟ ج: نعم. كما هو الحال مع السؤال السابق، لاحظنا نشاطًا ممتازًا لإنزيم نيورامينيداز α2-3,6,8 عند مستويات حموضة مرتفعة ومنخفضة، ووجدنا أيضًا أنه يعمل بكفاءة عالية على البروتينات المتغيرة بنيتها. يُظهر إنزيم نيورامينيداز نشاطًا طبيعيًا حتى في وجود 1% من مستخلص بذور الكتان (BME) و0.5% من كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS). س: هل إنزيم نيورامينيداز α2-3,6,8 نشط عند مستويات حموضة مرتفعة؟ ج: نعم. يتميز إنزيم نيورامينيداز α2-3,6,8 بنطاق واسع جدًا لتأثيره على الحموضة. على الرغم من أن درجة الحموضة المثلى تبلغ حوالي 5.5، إلا أننا نلاحظ إزالة ممتازة لحمض السياليك عند درجات حموضة منخفضة تصل إلى 4.5 وعالية تصل إلى 8.5. استخدمنا إنزيم نيورامينيداز α2-3,6,8 عند نطاقات حموضة (pH) أكثر ملاءمة لإنزيم PNGase F (نطاق حموضة 7.5-8.6). س: ما هي كمية الإكسوغليكوزيداز اللازمة؟ ج: تختلف كمية الإنزيم المطلوبة باختلاف الركائز المستخدمة. ابدأ بـ 1-2 ميكرولتر لكل 1 ميكروغرام من البروتين السكري أو 100 نانومول من السكريات قليلة الوحدات لمدة ساعة واحدة في تفاعل حجمه 10-25 ميكرولتر. إذا بقيت مواد غير مهضومة، اترك التفاعل طوال الليل. س: هل تثبط المنظفات عمل الإكسوغليكوزيدازات/الإندوغليكوزيدازات؟ ج: عند مستويات معتدلة (0.5-1.0% من المنظفات الأيونية وغير الأيونية)، تُظهر معظم الجليكوزيدازات نشاطًا مُرضيًا أو لا تتأثر. باستثناءاتٍ مثل: إنزيم PNGase F (بجميع تركيباته)، وإنزيم O-جليكوسيداز، وإنزيم β-N-أسيتيل جلوكوزامينيداز، والتي يُثبَّط عملها بواسطة SDS. من الضروري إضافة NP-40 بتركيز نهائي 1% إلى مزيج التفاعل لمعادلة تثبيط المنظفات. يُثبَّط إنزيم Endo D أيضًا بواسطة SDS، إلا أن NP-40 لا يُعادل هذا التثبيط. أخيرًا، يمكن للمواد المُثبِّتة الشائعة مثل Tween وTriton X-100 وNP-40 وأوكتيل جلوكوزيد وسلفوبيتينات غير المنظفة، بالإضافة إلى آثار المذيبات العضوية، أن تمنع عملية إزالة الجليكوزيل السريعة المثلى بواسطة إنزيم Rapid PNGase F. س: ما هو عنصر التحكم الإيجابي الجيد لإنزيم α2-3,6,8 نيورامينيداز؟ ج: نقترح استخدام فيتوين (NEB #P6042). يمكن ملاحظة التغيرات في الوزن الجزيئي للفيوتين بعد إزالة السكريات باستخدام تقنية SDS-PAGE. بدلاً من ذلك، يمكن استخدام الركيزة الكروموجينية pNP-N-acetyl-neuraminic acid لتصوير الوزن الجزيئي. س: لماذا غيّرت إنزيمات NEB Glycosidase محاليل التفاعل؟ ما هي محاليل التفاعل الجديدة، وهل لا يزال بإمكاني استخدام الإنزيم مع محلوله القديم؟ أين يمكنني العثور على تركيبة المحاليل القديمة؟ ج: لتبسيط إجراءات العمل والهضم باستخدام اثنين أو أكثر من إنزيمات exoglycosidase، يتم الآن تزويد معظم الإنزيمات بمحلول GlycoBuffer 1 بتركيز 10X. ويُستثنى من ذلك إنزيمان مزودان بمحلول GlycoBuffer 4. كما تم تبسيط مجموعة محاليل إنزيمات endoglycosidase. تم تقييم نشاط كل إنزيم endo- وexoglycosidase في كل من نظام المحلول القديم والجديد. احتفظت جميع الإنزيمات إما بنفس النشاط، أو وُجد أن نشاطها أكبر في المحلول الجديد. لا تزال بعض الإكسوغليكوزيدازات تُزوَّد بقارورة إضافية من rHSA (يعزز rHSA نشاط بعض الإنزيمات). وكما في السابق، لا تزال بعض الإكسوغليكوزيدازات تُزوَّد بقارورة إضافية من BSA (يعزز BSA نشاط بعض الإنزيمات). ولا تزال المكونات الأخرى (مثل محلول تسييل البروتينات السكرية، وNP-40، إلخ) تُزوَّد عند الحاجة. رقم منتج الإنزيم، المحلول القديم، المحلول الحالي، هل تم تغييره؟ إنزيم ألفا-إن-أسيتيل جالاكتوزامينيداز P0734 G7 جليكوبافر 1 نعم، إنزيم ألفا1-2 فوكوسيداز P0724 G4 جليكوبافر 1 نعم، إنزيم ألفا1-2،3،4،6 فوكوسيداز P0748 --- جليكوبافر 1 --- إنزيم ألفا1-2،4،6 فوكوسيداز O p0749 --- جليكوبافر 1 --- إنزيم ألفا1-3،4 فوكوسيداز p0769 --- جليكوبافر 1 --- إنزيم ألفا1-2،3 مانوسيداز P0729 G6 جليكوبافر 1 لا، إنزيم ألفا1-6 مانوسيداز P0727 G2 جليكوبافر 1 نعم، إنزيم ألفا1-2،3،6 مانوسيداز p0768 --- جليكوبافر 4 --- غالاكتوزيداز α1-3,4,6 P0747 --- غليكوبافر 1 ---- غالاكتوزيداز α1-3,6 P0731 G6 غليكوبافر 1 لا نيورامينيداز α2-3 S P0743 --- غليكوبافر 1 --- نيورامينيداز α2-3,6,8 P0720 G1 غليكوبافر 1 نعم نيورامينيداز α2-3,6,8,9 A P0722 --- غليكوبافر 1 --- β-N-أسيتيل هيكسوزامينيداز P0721 G2 غليكوبافر 1 نعم β-N-أسيتيل غلوكوزامينيداز P0732 G1 غليكوبافر 1 نعم β-N-أسيتيل غلوكوزامينيداز S P0744 --- غليكوبافر 1 --- β1-3 جالاكتوزيداز P0726 G6 GlycoBuffer 1 لا β1-4 جالاكتوزيداز S P0745 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3,4 جالاكتوزيداز p0746 --- GlycoBuffer 4 --- N-Glycan Sequencing Kit E0577 --- GlycoBuffer 1 --- Endo S P0741 G6 GlycoBuffer 1 نعم Endo H P0702 G5 GlycoBuffer 3 نعم Endo Hf P0703 G5 GlycoBuffer 3 نعم Endo F2 p0772 --- GlycoBuffer 4 --- Endo F3 p0771 --- GlycoBuffer 4 --- Endo D P0742 G7 GlycoBuffer 2 لا O-Glycosidase P0733 G7 مجموعة GlycoBuffer 2 بدون O-Glycosidase و Neuraminidase E0540 G7 GlycoBuffer 2 بدون Remove-iT® PNGase F P0706 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F P0704 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F (خالي من الجلسرين) P0705 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F، مُعاد التركيب P0708 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F (خالي من الجلسرين)، مُعاد التركيب P0709 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase A p0707 --- Glyco Buffer 3 --- مزيج إزالة الغليكوزيل من البروتين II p6044 --- مزيج إزالة الغليكوزيل Buffer 1 و 2 --- Rapid PNGase F P0710 --- Rapid PNGase F Buffer ---- Rapid™ PNGase F (صيغة غير مُختزلة) p0711 --- محلول منظم سريع لإنزيم PNGase F (صيغة غير مختزلة) س: ما هي الجليكوسيدازات وما استخداماتها؟ ج: تُستخدم الجليكوسيدازات للحصول على معلومات حول مجموعات الكربوهيدرات المرتبطة بالبروتينات السكرية والببتيدات السكرية. وهي نوعان: إندوجليكوسيدازات التي تفصل مجموعات الكربوهيدرات بالكامل عن البروتينات، وإكسوجليكوسيدازات التي تزيل السكريات الأحادية من النهايات غير المختزلة للكربوهيدرات. أما النهاية المختزلة فهي تلك التي يُنتجها إندوجليكوسيداز. غالبًا ما يستخدم الباحثون إندوجليكوسيداز متبوعًا بواحد أو أكثر من الإكسوجليكوسيدازات، ثم يحللون النواتج باستخدام SDS-PAGE أو أنواع مختلفة من الكروماتوغرافيا السائلة. س: هل من الضروري معالجة البروتين السكري الخاص بي في الوقت نفسه باستخدام نيورامينيداز وO-جليكوسيداز؟ ج: نعم. يجب إزالة بقايا حمض النيورامينيك لتمكين إنزيم O-جليكوسيداز من شطر ثنائيات السكاريد المرتبطة بروابط O. يعمل إنزيم نيورامينيداز عام (NEB #P0720) بكفاءة. كما يتوفر أيضًا مزيج من إنزيم O-جليكوسيداز وإنزيم نيورامينيداز (NEB# E0540S). س: هل تقوم إنزيمات نيورامينيداز NEB بشطر كل من بقايا حمض N-أسيتيل نيورامينيك (Neu5Ac) وحمض N-جليكوليل نيورامينيك (Neu5Gc)؟ ج: اعتمادًا على مصدر الإنزيم ونوعيته، تقوم بعض إنزيمات نيورامينيداز بشطر كل من Neu5Ac وNeu5Gc، بينما يقوم بعضها الآخر بشطر Neu5Ac فقط. تميل تلك التي تشطر كلًا من Neu5Ac وNeu5Gc إلى أن تكون أقل كفاءة تجاه Neu5Gc. NEB# P0720 (نيورامينيداز α2-3,6,8) – يقطع كلاً من Neu5Ac وNeu5Gc. NEB# P0722 (نيورامينيداز α2-3,6,8,9 A) – يقطع كلاً من Neu5Ac وNeu5Gc. NEB# P0743 (نيورامينيداز α2-3 S) – يقطع Neu5Ac فقط.