نيو إنجلاند بيولابس، P0721S، β-N-أسيتيل هيكسوزامينيداز

β- الفئات ذات الصلة تطبيقات الإكسوغليكوزيداز تسلسل الغليكان، والتعبير عن البروتين السكري المؤتلف، وتحليل البروتين السكري المواصفات تعريف الوحدة يتم تعريف الوحدة الواحدة على أنها كمية الإنزيم المطلوبة لفصل > 95٪ من β-D-N-أسيتيل جالاكتوزامين الطرفي من 1 نانومول من GalNAcβ1-4Galβ1-4Glc-7-أمينو-4-ميثيل-كومارين (AMC)، في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول جليكوبازر 1 بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول جليكوبازر 1 بتركيز 1X، 5 ملي مولار كلوريد الكالسيوم، 50 ملي مولار أسيتات الصوديوم (الأس الهيدروجيني 5.5 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين : 50 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 20 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 5 ملي مولار إيديتات ثنائي الصوديوم (الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية) . التثبيط الحراري : 75 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الوزن الجزيئي النظري: 100 كيلو دالتون . شروط فحص الوحدة : يتم تحضين تخفيفات متسلسلة من β-N-أسيتيل-هيكسوزامينيداز f مع 1 نانومول من الركيزة الموسومة بـ AMC في محلول جليكوبازر 1 بتركيز 1X في تفاعل حجمه 10 ميكرولتر. يُحضن مزيج التفاعل لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. يتم تصوير فصل نواتج التفاعل باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (3). الأسئلة الشائعة : س: ما هي كمية الإكسوغليكوزيداز اللازمة؟ ج: تختلف كمية الإنزيم المطلوبة باختلاف الركائز المستخدمة. ابدأ بـ 1-2 ميكرولتر لكل 1 ميكروغرام من البروتين السكري أو 100 نانومول من قليل السكاريد لمدة ساعة واحدة في تفاعل حجمه 10-25 ميكرولتر. إذا بقيت مواد غير مهضومة، اترك التفاعل طوال الليل. س: هل تُثبّط المنظفات الإكسوغليكوزيداز/الإندوغليكوزيداز؟ ج: عند مستويات معتدلة (0.5-1.0% من المنظفات الأيونية وغير الأيونية)، تُظهر معظم الجليكوزيدازات نشاطًا مُرضيًا أو لا تتأثر. الاستثناءات هي: PNGase F (جميع التركيبات)، وO-جليكوزيداز، وβ-N-أسيتيل جلوكوزامينيداز، والتي تُثبّط بواسطة SDS. من الضروري إضافة NP-40 بتركيز نهائي 1% إلى مزيج التفاعل لمعادلة تثبيط المنظفات. يُثبَّط إنزيم Endo D أيضًا بواسطة SDS، إلا أن NP-40 لا يُعادل هذا التثبيط. أخيرًا، يمكن للمواد المُثبِّتة الشائعة مثل Tween وTriton X-100 وNP-40 و octyl glucoside و sulfobetaines غير المُنظِّفة، بالإضافة إلى آثار المذيبات العضوية، أن تمنع إزالة الغليكوزيل السريعة المثلى بواسطة Rapid PNGase F. س: ما هو عنصر التحكم الإيجابي الجيد لـ β-N-Acetylhexosaminidasef؟ ج: p-Nitrophenyl-N-Acetyl-β-D-glucosamine (pNP-GlcNAc). س: ما هي الغليكوزيدازات وما استخداماتها؟ ج: تُستخدم الغليكوزيدازات للحصول على معلومات حول مجموعات الكربوهيدرات المرتبطة بالبروتينات السكرية والببتيدات السكرية. تأتي هذه الإنزيمات بنوعين: إنزيمات إندوغليكوزيداز التي تفصل مجموعات الكربوهيدرات الكاملة عن البروتينات، وإنزيمات إكسوغليكوزيداز التي تزيل السكريات الأحادية من النهايات غير المختزلة للكربوهيدرات. أما النهاية المختزلة فهي تلك التي ينتجها إنزيم إندوغليكوزيداز. يستخدم الباحثون عادةً إنزيم إندوغليكوزيداز متبوعًا بإنزيم إكسوغليكوزيداز واحد أو أكثر، ثم يحللون النواتج باستخدام تقنية SDS-PAGE أو أنواع مختلفة من كروماتوغرافيا السائل. س: لماذا غيّرت إنزيمات NEB Glycosidase محاليل التفاعل؟ ما هي محاليل التفاعل الجديدة، وهل ما زال بإمكاني استخدام الإنزيم مع محلوله القديم؟ أين يمكنني العثور على تركيبة المحاليل القديمة؟ ج: لتبسيط إجراءات العمل والهضم باستخدام اثنين أو أكثر من إنزيمات إكسوغليكوزيداز، تُزوَّد معظم الإنزيمات الآن بمحلول GlycoBuffer 1 بتركيز 10X. ويُستثنى من ذلك إنزيمان يُزوَّدان بمحلول GlycoBuffer 4. كما تم تبسيط مجموعة محاليل التفاعل لإنزيمات إندوغليكوزيداز. تم تقييم نشاط كل إنزيم من إنزيمات الإندو- والإكسوغليكوزيداز في كلٍ من نظام المحلول القديم والجديد. احتفظت جميع الإنزيمات إما بنفس النشاط، أو وُجد أن نشاطها أكبر في المحلول الجديد. لا تزال بعض الإكسوغليكوزيدازات مزودة بقارورة إضافية من rHSA (يعزز rHSA نشاط بعض الإنزيمات). وكما في السابق، لا تزال بعض الإكسوغليكوزيدازات مزودة بقارورة إضافية من BSA (يعزز BSA نشاط بعض الإنزيمات). لا تزال المكونات الأخرى (مثل محلول تمسخ البروتينات السكرية، NP-40، إلخ) متوفرة عند الحاجة. رقم المنتج الإنزيمي، المحلول القديم، المحلول الحالي، هل تم التغيير؟ إنزيم ألفا-إن-أسيتيل جالاكتوزامينيداز P0734 G7 جليكوبافر 1 نعم، إنزيم ألفا1-2 فوكوسيداز P0724 G4 جليكوبافر 1 نعم، إنزيم ألفا1-2،3،4،6 فوكوسيداز P0748 --- جليكوبافر 1 --- إنزيم ألفا1-2،4،6 فوكوسيداز O p0749 --- جليكوبافر 1 --- إنزيم ألفا1-3،4 فوكوسيداز p0769 --- جليكوبافر 1 --- إنزيم ألفا1-2،3 مانوسيداز P0729 G6 جليكوبافر 1 لا، إنزيم ألفا1-6 مانوسيداز P0727 G2 جليكوبافر 1 نعم، إنزيم ألفا1-2،3،6 مانوسيداز p0768 --- جليكوبافر 4 --- غالاكتوزيداز α1-3,4,6 P0747 --- غليكوبافر 1 ---- غالاكتوزيداز α1-3,6 P0731 G6 غليكوبافر 1 لا نيورامينيداز α2-3 S P0743 --- غليكوبافر 1 --- نيورامينيداز α2-3,6,8 P0720 G1 غليكوبافر 1 نعم نيورامينيداز α2-3,6,8,9 A P0722 --- غليكوبافر 1 --- β-N-أسيتيل هيكسوزامينيداز P0721 G2 غليكوبافر 1 نعم β-N-أسيتيل غلوكوزامينيداز P0732 G1 غليكوبافر 1 نعم β-N-أسيتيل غلوكوزامينيداز S P0744 --- غليكوبافر 1 --- β1-3 جالاكتوزيداز P0726 G6 GlycoBuffer 1 لا β1-4 جالاكتوزيداز S P0745 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3,4 جالاكتوزيداز p0746 --- GlycoBuffer 4 --- N-Glycan Sequencing Kit E0577 --- GlycoBuffer 1 --- Endo S P0741 G6 GlycoBuffer 1 نعم Endo H P0702 G5 GlycoBuffer 3 نعم Endo Hf P0703 G5 GlycoBuffer 3 نعم Endo F2 p0772 --- GlycoBuffer 4 --- Endo F3 p0771 --- GlycoBuffer 4 --- Endo D P0742 G7 GlycoBuffer 2 لا O-Glycosidase P0733 G7 مجموعة GlycoBuffer 2 بدون O-Glycosidase و Neuraminidase E0540 G7 GlycoBuffer 2 بدون Remove-iT® PNGase F P0706 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F P0704 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F (خالي من الجلسرين) P0705 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F، مُعاد التركيب P0708 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F (خالي من الجلسرين)، مُعاد التركيب P0709 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase A p0707 --- Glyco Buffer 3 --- مزيج إزالة الغليكوزيل من البروتين II p6044 --- مزيج إزالة الغليكوزيل Buffer 1 و 2 --- Rapid PNGase F P0710 --- Rapid PNGase F Buffer ---- Rapid™ PNGase F (صيغة غير مُختزلة) p0711 --- مُخزن مؤقت سريع لإنزيم PNGase F (تنسيق غير مُختزل)