نيو إنجلاند بيولابس، P0722L، نيورامينيداز أ α2-3،6،8،9

إنزيم نيورامينيداز A α2-3,6,8,9 هو سياليداز واسع التخصص، يقوم بفصل بقايا حمض السياليك الطرفية غير المختزلة، سواءً كانت خطية أو متفرعة، من البروتينات السكرية، والببتيدات السكرية، والسكريات قليلة الوحدات. يُستخدم هذا الإنزيم في تحليل وتوصيف السكريات، وإعادة تشكيل البروتينات السكرية السليمة. (الفئات ذات الصلة : الإكسوغليكوزيدازات، تطبيقات تحليل البروتينات، أنظمة التعبير، تسلسل السكريات، علم البروتينات). تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لفصل أكثر من 95% من α-Neu5Ac الطرفي من 1 نانومول من Neu5Acα2-3Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc-AMC، خلال ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول جليكوبازر 1 بتركيز 1X، حضانة عند 37 درجة مئوية. محلول جليكوبازر 1 بتركيز 1X، 5 ملي مولار كلوريد الكالسيوم، 50 ملي مولار أسيتات الصوديوم (الأس الهيدروجيني 5.5 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين : 50 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 20 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 1 ملي مولار إيديتات ثنائي الصوديوم (الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية). التثبيط الحراري : 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الوزن الجزيئي الظاهري : 100 كيلو دالتون. النشاط النوعي : 316,000 وحدة/ملغ . شروط قياس الوحدة: يتم تحضين تخفيفات متسلسلة من نيورامينيداز α2-3,6,8,9 A مع 1 نانومول من الركيزة الموسومة بـ AMC ومحلول جليكوبازر 1 بتركيز 1X في تفاعل حجمه 10 ميكرولتر. يتم تحضين مزيج التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. يتم تصوير فصل نواتج التفاعل باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (2). الأسئلة الشائعة : س: ما الفرق بين إنزيمات النيورامينيداز الأربعة التي تبيعها شركة NEB: نيورامينيداز α2-3,6,8، ونيورامينيداز α2-3,6,8,9 A، ونيورامينيداز α2-3، ونيورامينيداز α2-3 S؟ ج: إنزيم نيورامينيداز α2-3,6,8 (NEB# P0720) مستنسخ من بكتيريا كلوستريديوم بيرفرينجنز، ويقوم بفصل بقايا حمض السياليك المرتبطة بروابط α2-3، وα2-6، وα2-8. إنزيم نيورامينيداز A α2-3,6,8,9 (NEB# P0722) مستنسخ من بكتيريا Arthrobacter ureafaciens، ويقوم بفصل بقايا حمض السياليك المرتبطة بروابط α2-3، وα2-6، وα2-8، وα2-9. كما يمكنه فصل بقايا حمض السياليك المتفرعة المرتبطة ببقايا داخلية. إنزيم نيورامينيداز α2-3 (NEB# P0728) مستنسخ من بكتيريا Salmonella typhimurium LT2، ويقوم بفصل بقايا حمض السياليك المرتبطة بروابط α2-3. إنزيم نيورامينيداز S α2-3 (NEB# P0743) مستنسخ من بكتيريا Streptococcus pneumoniae، ويقوم بفصل بقايا حمض السياليك المرتبطة بروابط α2-3. س: ما هو عنصر التحكم الإيجابي المناسب لإنزيم نيورامينيداز A α2-3,6,8,9؟ ج: فيتوين (NEB# P6042) أو حمض pNP-N-أسيتيل-نيورامينيك. س: هل يمكنني استخدام نيورامينيداز α2-3,6,8,9 A في عملية هضم مزدوجة مع إنزيمات إكسوغليكوزيداز و/أو إندوغليكوزيداز أخرى؟ ج: نعم. نوصي بإجراء عملية هضم مزدوجة لنيورامينيداز α2-3,6,8,9 A مع إنزيمات إكسوغليكوزيداز أخرى باستخدام محلول غليكوبفر 1 (50 مليمولار أسيتات الصوديوم، درجة الحموضة 5.5، 5 مليمولار كلوريد الكالسيوم). كما نوصي باستخدام محلول تفاعل G7 (50 مليمولار فوسفات الصوديوم، درجة الحموضة 7.5) لهضم نيورامينيداز α2-3,6,8,9 A باستخدام إنزيم PNGase F و/أو إنزيم O-غليكوزيداز. س: هل يمكنني استخدام إنزيم نيورامينيداز α2-3,6,8,9 A في عملية هضم مزدوجة مع إنزيم Endo H/Hf أو O-Glycosidase أو PNGase F؟ ج: نعم. يتميز إنزيم نيورامينيداز α2-3,6,8,9 A بنشاطه ضمن نطاق واسع من الرقم الهيدروجيني، وقد ثبتت فعاليته على البروتينات التي تعرضت للتمسخ. يُظهر إنزيم نيورامينيداز نشاطًا طبيعيًا حتى في وجود 1% من BME و0.5% من SDS. س: هل يتطلب هذا الإنزيم ظروفًا مُفسِّخة ليعمل على البروتينات السكرية؟ ج: لا، بشكل عام، تستطيع إنزيمات الإكسوغليكوزيداز إزالة بقايا السكر من البروتينات السكرية الأصلية (المطوية) (حيث تتجه السكريات المحبة للماء بعيدًا عن هيكل البروتين). مع ذلك، قد يؤثر طي البروتين حول موقع السكري على إمكانية وصول الإنزيم إليه. يتطلب هضم بعض البروتينات بواسطة إنزيمات الإكسوغليكوزيداز فترات حضانة أطول، أو في بعض الحالات درجة معتدلة من التمسخ. س: ما هي أفضل طريقة لإعادة تنقية الجليكان أو الجليكوبروتين بعد المعالجة بالإكسوجليكوزيداز؟ ج: الترشيح باستخدام مرشحات دقيقة دوارة، أو الاستخلاص الطوري الصلب (على سبيل المثال: خراطيش الكربون المُجرافيت). س: هل تُثبط المنظفات الجليكوزيدازات؟ ج: عند مستويات معتدلة (0.5-1.0% من المنظفات الأيونية وغير الأيونية)، تُظهر معظم الجليكوزيدازات نشاطًا مُرضيًا أو لا تتأثر. تشمل الاستثناءات PNGase F، وPNGase F المُعاد تركيبه، وRemove-iT PNGase F، وO-Glycosidase التي تُثبطها SDS. س: ما هي الجليكوزيدازات وما استخداماتها؟ ج: تُستخدم الجليكوزيدازات للحصول على معلومات حول مجموعات الكربوهيدرات المرتبطة بالجليكوبروتينات والجليكوببتيدات. تأتي هذه الإنزيمات بنوعين: إنزيمات إندوغليكوزيداز التي تفصل مجموعات الكربوهيدرات الكاملة عن البروتينات، وإنزيمات إكسوغليكوزيداز التي تزيل السكريات الأحادية من النهايات غير المختزلة للكربوهيدرات. أما النهاية المختزلة فهي تلك التي ينتجها إنزيم إندوغليكوزيداز. يستخدم الباحثون عادةً إنزيم إندوغليكوزيداز متبوعًا بواحد أو أكثر من إنزيمات إكسوغليكوزيداز، ثم يحللون النواتج باستخدام تقنية SDS-PAGE أو أنواع مختلفة من الاستشراب السائل. س: هل تفصل إنزيمات نيورامينيداز NEB كلاً من حمض N-أسيتيل نيورامينيك (Neu5Ac) وحمض N-غليكوليل نيورامينيك (Neu5Gc)؟ ج: اعتمادًا على مصدر الإنزيم وتخصصه، تفصل بعض إنزيمات نيورامينيداز كلاً من Neu5Ac وNeu5Gc، بينما يفصل بعضها الآخر Neu5Ac فقط. وتميل تلك التي تفصل كلاً من Neu5Ac وNeu5Gc إلى أن تكون أقل كفاءة تجاه Neu5Gc. NEB# P0720 (نيورامينيداز α2-3,6,8) - يحلل كلاً من Neu5Ac وNeu5Gc. NEB# P0722 (نيورامينيداز α2-3,6,8,9 A) - يحلل كلاً من Neu5Ac وNeu5Gc. NEB# P0743 (نيورامينيداز α2-3 S) - يحلل Neu5Ac فقط. س: هل من الضروري معالجة البروتين السكري الخاص بي بالنيورامينيداز وO-جليكوسيداز في آن واحد؟ ج: نعم. يجب إزالة بقايا حمض النيورامينيك للسماح لـO-جليكوسيداز بتحليل ثنائيات السكاريد المرتبطة بـO. يعمل النيورامينيداز العام (NEB #P0720) بشكل جيد. بالإضافة إلى ذلك، تتوفر حزمة O-جليكوسيداز ونيورامينيداز (NEB# E0540S). س: ما هي كمية الإكسوغليكوزيداز اللازمة؟ ج: تختلف كمية الإنزيم المطلوبة باختلاف الركائز المستخدمة. ابدأ بـ 1-2 ميكرولتر لكل 1 ميكروغرام من البروتين السكري أو 100 نانومول من السكريات قليلة الوحدات لمدة ساعة واحدة في تفاعل حجمه 10-25 ميكرولتر. إذا بقيت مواد غير مهضومة، اترك التفاعل طوال الليل.