نيو إنجلاند بيولابس، P0727S، مانوسيداز α1-6

إنزيم مانوسيداز α1-6 هو إنزيم إكسوغليكوزيداز عالي التخصص، يعمل على إزالة بقايا المانوز غير المتفرعة المرتبطة بروابط α1-6 من السكريات قليلة الوحدات. التصنيفات ذات الصلة : تطبيقات الإكسوغليكوزيداز، التعبير عن البروتينات السكرية المؤتلفة. تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لفصل أكثر من 95% من مانوز α-D الطرفي من 1 نانومول من Manα1-6Manα1-6Man-7-أمينو-4-ميثيل-كومارين (AMC)، خلال ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول جليكوبازر 1 بتركيز 1X، مضاف إليه 100 ميكروغرام/مل من الألبومين المؤتلف (منخفض الجلسرين)، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول جليكوبازر 1 بتركيز 1X، 5 ملي مولار من كلوريد الكالسيوم، 50 ملي مولار من أسيتات الصوديوم (الأس الهيدروجيني 5.5 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 50 ملي مولار من كلوريد الصوديوم، 20 ملي مولار من Tris-HCl، 1 ملي مولار من EDTA، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري : 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الوزن الجزيئي الظاهري : 51 كيلو دالتون. شروط فحص الوحدة: يتم تحضين تخفيفات متسلسلة من إنزيم α1-6 مانوزيداز مع 1 نانومول من الركيزة الموسومة بـ AMC في محلول جليكوبازر 1 بتركيز 1X، مضاف إليه 100 ميكروغرام/مل من rHSA، في تفاعل حجمه 10 ميكرولتر. يُحضن مزيج التفاعل لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. تُفحص نواتج التفاعل باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (1). الأسئلة الشائعة : س: ما هو عنصر التحكم الإيجابي المناسب لإنزيم ألفا-1-6 مانوسيداز؟ ج: لا يُعدّ p-نيتروفينيل-ألفا-دي-مانوبيرانوزيد (pNP-Man) ركيزةً لهذا الإنزيم. س: ما هي كمية الإكسوجليكوسيداز اللازمة؟ ج: تختلف كمية الإنزيم المطلوبة باختلاف الركائز المستخدمة. ابدأ بـ 1-2 ميكرولتر لكل 1 ميكروغرام من البروتين السكري أو 100 نانومول من قليل السكاريد لمدة ساعة واحدة في تفاعل حجمه 10-25 ميكرولتر. إذا بقيت مواد غير مهضومة، اترك التفاعل طوال الليل. س: لماذا غيّرت شركة NEB Glycosidase محاليل التفاعل؟ ما هي محاليل التفاعل الجديدة، وهل ما زال بإمكاني استخدام الإنزيم مع محلوله القديم؟ أين يمكنني العثور على تركيبة المحاليل المنظمة القديمة؟ ج: لتبسيط إجراءات العمل والهضم باستخدام اثنين أو أكثر من الإكسوغليكوزيدازات، تُزوَّد معظم الإنزيمات الآن بمحلول غليكوبفر 1 بتركيز 10X. ويُستثنى من ذلك إنزيمان يُزوَّدان بمحلول غليكوبفر 4. كما تم تبسيط مجموعة المحاليل المنظمة للإندوغليكوزيدازات. وقد تم تقييم نشاط كل إنزيم من الإندوغليكوزيدازات والإكسوغليكوزيدازات في كل من نظام المحلول المنظم القديم والجديد. احتفظت جميع الإنزيمات إما بنفس النشاط، أو وُجد أن نشاطها أكبر في المحلول المنظم الجديد. لا تزال بعض الإكسوغليكوزيدازات تُزوَّد بقارورة إضافية من rHSA (يعزز rHSA نشاط بعض الإنزيمات). وكما كان الحال سابقًا، لا تزال بعض الإكسوغليكوزيدازات تُزوَّد بقارورة إضافية من BSA (يعزز BSA نشاط بعض الإنزيمات). ولا تزال المكونات الأخرى (مثل محلول تسييل البروتينات السكرية، وNP-40، وما إلى ذلك) متوفرة عند الحاجة. رقم المنتج الإنزيمي: المحلول القديم المحلول الحالي هل تم تغييره؟ إنزيم ألفا-إن-أسيتيل جالاكتوزامينيداز P0734 G7 جليكوبافر 1 نعم، إنزيم ألفا1-2 فوكوسيداز P0724 G4 جليكوبافر 1 نعم، إنزيم ألفا1-2،3،4،6 فوكوسيداز P0748 --- جليكوبافر 1 --- إنزيم ألفا1-2،4،6 فوكوسيداز O p0749 --- جليكوبافر 1 --- إنزيم ألفا1-3،4 فوكوسيداز p0769 --- جليكوبافر 1 --- إنزيم ألفا1-2،3 مانوسيداز P0729 G6 جليكوبافر 1 لا، إنزيم ألفا1-6 مانوسيداز P0727 G2 جليكوبافر 1 نعم، إنزيم ألفا1-2،3،6 مانوسيداز p0768 --- جليكوبافر 4 --- غالاكتوزيداز α1-3,4,6 P0747 --- غليكوبافر 1 ---- غالاكتوزيداز α1-3,6 P0731 G6 غليكوبافر 1 لا نيورامينيداز α2-3 S P0743 --- غليكوبافر 1 --- نيورامينيداز α2-3,6,8 P0720 G1 غليكوبافر 1 نعم نيورامينيداز α2-3,6,8,9 A P0722 --- غليكوبافر 1 --- β-N-أسيتيل هيكسوزامينيداز P0721 G2 غليكوبافر 1 نعم β-N-أسيتيل غلوكوزامينيداز P0732 G1 غليكوبافر 1 نعم β-N-أسيتيل غلوكوزامينيداز S P0744 --- غليكوبافر 1 --- β1-3 جالاكتوزيداز P0726 G6 GlycoBuffer 1 لا β1-4 جالاكتوزيداز S P0745 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3,4 جالاكتوزيداز p0746 --- GlycoBuffer 4 --- N-Glycan Sequencing Kit E0577 --- GlycoBuffer 1 --- Endo S P0741 G6 GlycoBuffer 1 نعم Endo H P0702 G5 GlycoBuffer 3 نعم Endo Hf P0703 G5 GlycoBuffer 3 نعم Endo F2 p0772 --- GlycoBuffer 4 --- Endo F3 p0771 --- GlycoBuffer 4 --- Endo D P0742 G7 GlycoBuffer 2 لا O-Glycosidase P0733 G7 مجموعة GlycoBuffer 2 بدون O-Glycosidase و Neuraminidase E0540 G7 GlycoBuffer 2 بدون Remove-iT® PNGase F P0706 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F P0704 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F (خالي من الجلسرين) P0705 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F، مُعاد التركيب P0708 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F (خالي من الجلسرين)، مُعاد التركيب P0709 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase A p0707 --- Glyco Buffer 3 --- مزيج إزالة الغليكوزيل من البروتين II p6044 --- مزيج إزالة الغليكوزيل Buffer 1 و 2 --- Rapid PNGase F P0710 --- Rapid PNGase F Buffer ---- Rapid™ PNGase F (صيغة غير مُختزلة) p0711 --- محلول منظم سريع لإنزيم PNGase F (غير مُختزل) س: هل تُثبّط المنظفات إنزيمات الجليكوسيداز الخارجية/الداخلية؟ ج: عند مستويات معتدلة (0.5-1.0% من المنظفات الأيونية وغير الأيونية)، تُظهر معظم إنزيمات الجليكوسيداز نشاطًا مُرضيًا أو لا تتأثر. الاستثناءات هي: إنزيم PNGase F (جميع التركيبات)، وإنزيم O-جليكوسيداز، وإنزيم β-N-أسيتيل جلوكوزامينيداز، والتي يُثبّطها SDS. من الضروري إضافة NP-40 بتركيز نهائي 1% إلى خليط التفاعل لمواجهة تثبيط المنظفات. يُثبّط إنزيم Endo D أيضًا بواسطة SDS، ولكن NP-40 لا يُعاكس هذا التثبيط. أخيرًا، يمكن للمواد المُثبِّتة الشائعة، مثل توين، وتريتون X-100، وNP-40، وأوكتيل جلوكوزيد، وسلفوبيتينات غير مُنظِّفة، بالإضافة إلى آثار المذيبات العضوية، أن تمنع عملية إزالة الغليكوزيل السريعة المثلى بواسطة إنزيم Rapid PNGase F. س: ما هي الجليكوزيدازات وما استخداماتها؟ ج: تُستخدم الجليكوزيدازات للحصول على معلومات حول مجموعات الكربوهيدرات المرتبطة بالبروتينات السكرية والببتيدات السكرية. وهي نوعان: إندوغليكوزيدازات التي تفصل مجموعات الكربوهيدرات بالكامل عن البروتينات، وإكسوغليكوزيدازات التي تزيل السكريات الأحادية من النهايات غير المُختزلة للكربوهيدرات. أما النهاية المُختزلة فهي تلك التي يُنتجها إندوغليكوزيداز. غالبًا ما يستخدم الباحثون إندوغليكوزيداز متبوعًا بواحد أو أكثر من الإكسوغليكوزيدازات، ثم يحللون النواتج باستخدام SDS-PAGE أو أنواع مختلفة من الكروماتوغرافيا السائلة.