نيو إنجلاند بيولابس، P0731S، غالاكتوزيداز α1-3,6

الفئات ذات الصلة تطبيقات الإكسوغليكوزيداز تسلسل الغليكان، والتعبير عن البروتين السكري المؤتلف، وتحليل البروتين السكري المواصفات تعريف الوحدة تُعرف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لفصل أكثر من 95٪ من الطرف، α-D-غالاكتوز من 1 نانومول من Galα1-3Galβ1-4Gal-7-أمينو-4-ميثيل-كومارين (AMC)، في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول غليكوبافر 1 بتركيز 1X، مضاف إليه 100 ميكروغرام/مل من الألبومين المؤتلف (منخفض الجلسرين). يُحضن عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. محلول غليكوبافر 1 بتركيز 1X، 5 ملي مولار من كلوريد الكالسيوم، 50 ملي مولار من أسيتات الصوديوم (الأس الهيدروجيني 5.5 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 20 ملي مولار من Tris-HCl، 50 ملي مولار من كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار من EDTA، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري : 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الوزن الجزيئي الظاهري : 70 كيلو دالتون . شروط فحص الوحدة: يتم تحضين تخفيفات متسلسلة ثنائية الطي من غالاكتوزيداز α1-3,6 مع 1 نانومول من الركيزة الموسومة بـ AMC في محلول غليكوبافر 1 بتركيز 1X وألبومين بشري مؤتلف بتركيز 1X في تفاعل حجمه 10 ميكرولتر. يُحضن مزيج التفاعل لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. ويتم فصل نواتج التفاعل باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (1). الأسئلة الشائعة : س: هل يمكنني استخدام إنزيم α1-3,6 جالاكتوزيداز في عملية هضم مزدوجة مع إنزيمات إكسوجليكوزيداز و/أو إندوجليكوزيداز أخرى؟ ج: نعم. نوصي باستخدام محلول جليكوبازر 2 بتركيز 1X لهضم إنزيم α1-3,6 جالاكتوزيداز باستخدام إنزيم PNGase F و/أو إنزيم O-جليكوزيداز. قم أولاً بهضم البروتين السكري باستخدام إنزيم PNGase F أو إنزيم O-جليكوزيداز، ثم قم بتعطيل الإنزيم بالحرارة عند درجة حرارة 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، ثم قم بمعالجته بإنزيم α1-3,6 جالاكتوزيداز في نفس محلول جليكوبازر 2 بتركيز 1X. س: ما هو عنصر التحكم الإيجابي المناسب لإنزيم α1-3,6 جالاكتوزيداز؟ ج: بارا-نيتروفينيل ألفا-دي-غالاكتوبيرانوزيد (اسم بديل: 4-نيتروفينيل ألفا-دي-غالاكتوبيرانوزيد)؛ هضم ليلي. س: ما هي الجليكوسيدازات وما استخداماتها؟ ج: تُستخدم الجليكوسيدازات للحصول على معلومات حول مجموعات الكربوهيدرات المرتبطة بالبروتينات السكرية والببتيدات السكرية. وهي نوعان: إندوجليكوسيدازات التي تفصل مجموعات الكربوهيدرات بالكامل عن البروتينات، وإكسوجليكوسيدازات التي تزيل السكريات الأحادية من النهايات غير المختزلة للكربوهيدرات. النهاية المختزلة هي تلك التي يُنتجها الإندوجليكوسيداز. غالبًا ما يستخدم الباحثون إندوجليكوسيداز متبوعًا بواحد أو أكثر من الإكسوجليكوسيدازات، ثم يحللون النواتج باستخدام SDS-PAGE أو أنواع مختلفة من الكروماتوغرافيا السائلة. س: ما هي كمية الإكسوجليكوسيداز التي يجب استخدامها؟ ج: تختلف كمية الإنزيم المطلوبة باختلاف الركائز المستخدمة. ابدأ بـ 1-2 ميكرولتر لكل 1 ميكروغرام من البروتين السكري أو 100 نانومول من السكريات قليلة الوحدات لمدة ساعة واحدة في تفاعل حجمه 10-25 ميكرولتر. إذا بقيت مواد غير مهضومة، اترك التفاعل طوال الليل. س: لماذا غيّرت إنزيمات NEB Glycosidase محاليل التفاعل؟ ما هي محاليل التفاعل الجديدة، وهل ما زال بإمكاني استخدام الإنزيم مع محلوله القديم؟ أين يمكنني العثور على تركيبة المحاليل القديمة؟ ج: لتبسيط إجراءات العمل والهضم باستخدام اثنين أو أكثر من إنزيمات exoglycosidase، يتم الآن تزويد معظم الإنزيمات بمحلول GlycoBuffer 1 بتركيز 10X. ويُستثنى من ذلك إنزيمان مزودان بمحلول GlycoBuffer 4. كما تم تبسيط مجموعة محاليل إنزيمات endoglycosidase. تم تقييم نشاط كل إنزيم endo- وexoglycosidase في كل من نظام المحلول القديم والجديد. تحتفظ جميع الإنزيمات إما بنفس النشاط، أو وُجد أن نشاطها قد ازداد في المحلول المنظم الجديد. لا تزال بعض الإكسوغليكوزيدازات مزودة بقارورة إضافية من rHSA (يعزز rHSA نشاط بعض الإنزيمات). وكما في السابق، لا تزال بعض الإكسوغليكوزيدازات مزودة بقارورة إضافية من BSA (يعزز BSA نشاط بعض الإنزيمات). ولا تزال المكونات الأخرى (مثل محلول إزالة طبيعة البروتينات السكرية، وNP-40، إلخ) متوفرة عند الحاجة. رقم منتج الإنزيم، المحلول المنظم القديم، المحلول المنظم الحالي، هل تم التغيير؟ إنزيم ألفا-إن-أسيتيل جالاكتوزامينيداز P0734 G7 جليكوبافر 1 نعم، إنزيم ألفا1-2 فوكوسيداز P0724 G4 جليكوبافر 1 نعم، إنزيم ألفا1-2،3،4،6 فوكوسيداز P0748 --- جليكوبافر 1 --- إنزيم ألفا1-2،4،6 فوكوسيداز O p0749 --- جليكوبافر 1 --- إنزيم ألفا1-3،4 فوكوسيداز p0769 --- جليكوبافر 1 --- إنزيم ألفا1-2،3 مانوسيداز P0729 G6 جليكوبافر 1 لا، إنزيم ألفا1-6 مانوسيداز P0727 G2 جليكوبافر 1 نعم، إنزيم ألفا1-2،3،6 مانوسيداز p0768 --- جليكوبافر 4 --- غالاكتوزيداز α1-3,4,6 P0747 --- غليكوبافر 1 ---- غالاكتوزيداز α1-3,6 P0731 G6 غليكوبافر 1 لا نيورامينيداز α2-3 S P0743 --- غليكوبافر 1 --- نيورامينيداز α2-3,6,8 P0720 G1 غليكوبافر 1 نعم نيورامينيداز α2-3,6,8,9 A P0722 --- غليكوبافر 1 --- β-N-أسيتيل هيكسوزامينيداز P0721 G2 غليكوبافر 1 نعم β-N-أسيتيل غلوكوزامينيداز P0732 G1 غليكوبافر 1 نعم β-N-أسيتيل غلوكوزامينيداز S P0744 --- غليكوبافر 1 --- β1-3 جالاكتوزيداز P0726 G6 GlycoBuffer 1 لا β1-4 جالاكتوزيداز S P0745 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3,4 جالاكتوزيداز p0746 --- GlycoBuffer 4 --- N-Glycan Sequencing Kit E0577 --- GlycoBuffer 1 --- Endo S P0741 G6 GlycoBuffer 1 نعم Endo H P0702 G5 GlycoBuffer 3 نعم Endo Hf P0703 G5 GlycoBuffer 3 نعم Endo F2 p0772 --- GlycoBuffer 4 --- Endo F3 p0771 --- GlycoBuffer 4 --- Endo D P0742 G7 GlycoBuffer 2 لا O-Glycosidase P0733 G7 مجموعة GlycoBuffer 2 بدون O-Glycosidase و Neuraminidase E0540 G7 GlycoBuffer 2 بدون Remove-iT® PNGase F P0706 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F P0704 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F (خالي من الجلسرين) P0705 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F، مُعاد التركيب P0708 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F (خالي من الجلسرين)، مُعاد التركيب P0709 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase A p0707 --- Glyco Buffer 3 --- مزيج إزالة الغليكوزيل من البروتين II p6044 --- مزيج إزالة الغليكوزيل Buffer 1 و 2 --- Rapid PNGase F P0710 --- Rapid PNGase F Buffer ---- Rapid™ PNGase F (صيغة غير مُختزلة) p0711 --- مُخزن مؤقت سريع لإنزيم PNGase F (تنسيق غير مُختزل)