نيو إنجلاند بيولابس، P0733L، جليكوسيداز O

إنزيم O-جليكوسيداز، المعروف أيضًا باسم إندو-ألفا-إن-أسيتيل جالاكتوزامينيداز، يحفز إزالة ثنائيات السكاريد المرتبطة بروابط O من النوعين Core 1 و Core 3 من البروتينات السكرية. التصنيفات ذات الصلة : إنزيمات إندوجليكوسيداز، تطبيقات تحليل البروتينات، أنظمة التعبير، تسلسل الجليكان، هضم البروتين. المواصفات : وحدة واحدة من الإنزيم تقطع 1 بيكومول من جليكوبروتين O المعالج بالنيورامينيداز والموسوم بـ FAM في ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. شروط التفاعل: محلول جليكوبازر 2 بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول جليكوبازر 2 بتركيز 1X، فوسفات الصوديوم 50 ملي مولار (الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 20 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 50 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار إيدتا، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري : 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الوزن الجزيئي الظاهري: 147 كيلو دالتون . شروط فحص الوحدة : تُضاف تخفيفات متسلسلة ثنائية الطي من إنزيم O-جليكوزيداز إلى مزيج التفاعل المكون من 2 بيكومول من ببتيد O-جليكوبروتين المعالج بالنيورامينيداز والموسوم بـ FAM في محلول جليكوبازر 2 بتركيز 1X. تُحضن التفاعلات عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. تُحدد كمية ببتيد O-جليكوبروتين منزوع الجليكوزيل بواسطة الفصل الكهربائي الشعيري. الأسئلة الشائعة : س: ما هي ظروف التفاعل النموذجية لإنزيم O-جليكوسيداز؟ ج: يجب تحديد أوقات الحضانة المثلى وتركيزات الإنزيم تجريبيًا لكل ركيزة على حدة. فيما يلي ظروف التفاعل النموذجية: امزج 10-20 ميكروغرام من البروتين السكري، و1 ميكرولتر من محلول التحلل البروتيني السكري 10X، والماء (إذا لزم الأمر) لتكوين حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر. قم بتفكيك البروتين السكري بتسخين التفاعل عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. حضّر حجم تفاعل إجمالي قدره 20 ميكرولتر بإضافة 2 ميكرولتر من محلول التحلل البروتيني السكري 10X، و2 ميكرولتر من NP-40 بتركيز 10%، و2 ميكرولتر من إنزيم نيورامينيداز، والماء، و1-5 ميكرولتر من إنزيم O-جليكوسيداز. حضّن التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 1-4 ساعات. ملاحظة: يمكن استخدام إنزيم O-Glycosidase في ظروف التمسخ أو الظروف الطبيعية. مع ذلك، في ظروف التمسخ، يتضاعف نشاط الإنزيم. وتعتمد هذه الملاحظة على الركيزة. يمكن زيادة حجم التفاعل خطيًا لاستيعاب كميات كبيرة من إنزيم O-Glycosidase وأحجام تفاعل أكبر. س: حاولتُ استخدام إنزيم O-Glycosidase على بروتين سكري خاص بي ولم ألاحظ إزالة الكربوهيدرات. ما المشكلة؟ ج: هل تعرف كيف ترتبط الكربوهيدرات بالبروتين؟ هل هي مرتبطة برابطة N أم O (مرتبطة بالأسباراجين، أو السيرين/الثريونين)؟ إنزيم PNGase F يزيل الكربوهيدرات المرتبطة بالأسباراجين فقط. بينما يزيل إنزيم O-Glycosidase ثنائيات السكاريد المرتبطة بروابط O من النوعين الأساسيين 1 و3 المرتبطين بالسيرين/الثريونين. إذا كنت متأكدًا من وجود كربوهيدرات مرتبطة بروابط O، فتأكد من معالجة البروتين السكري بإنزيم نيورامينيداز، وفصل البروتين قبل إزالة السكريات. قد تمنع البنية الثانوية والثالثية للبروتينات إنزيمات إندوغليكوزيداز من الوصول إلى ركائزها، مما يجعل فصل البروتين خطوة حاسمة في عملية الفصل الفعالة. إذا كنت لا ترغب في فصل البروتين، ففكر في إضافة المزيد من الإنزيم وزيادة مدة الحضانة. إذا كنت قد فصلت البروتين، فتأكد من إضافة NP-40 (لحماية إنزيم O-غليكوزيداز من SDS في خطوة الفصل). س: ما كمية إنزيم O-غليكوزيداز التي يجب استخدامها لإزالة الكربوهيدرات في الظروف الطبيعية؟ ج: عندما لا يكون البروتين مفصولًا، قد يواجه إنزيم O-غليكوزيداز صعوبة في الوصول إلى موقع فصل الكربوهيدرات (بسبب البنية الثانوية والثالثية للبروتين). في بعض الأحيان، قد يُفيد استخدام إنزيم إضافي وإطالة فترة الحضانة، لكن هذه القيم خاصة بكل بروتين ويجب تحديدها تجريبيًا. س: هل تُثبّط المنظفات إنزيم O-Glycosidase؟ ج: من الضروري إضافة NP-40 بتركيز نهائي 1% إلى مزيج التفاعل لمواجهة تثبيط المنظفات. يتمتع إنزيم O-Glycosidase بنشاطه الكامل في وجود 1% من NP-40. س: هل يُمكن استخدام إنزيم Neuraminidase مع إنزيم PNGase F وإنزيم O-Glycosidase في عملية هضم؟ ج: نعم. تم تحديد الظروف (السؤال والجواب رقم 1) التي تسمح باستخدام إنزيم O-Glycosidase في ظل نفس ظروف التمسخ المستخدمة مع إنزيم PNGase F. يُمكن استخدام إنزيم PNGase F وإنزيم O-Glycosidase معًا في تفاعل مع محلول التفاعل G7 بتركيز 1X، و10% من NP-40، وإنزيم Neuraminidase، والماء، والبروتين السكري. يتميز إنزيم النيورامينيداز بنطاق واسع جدًا من الرقم الهيدروجيني، حيث يكون نشطًا بين 4.5 و8.5. وهو فعال للغاية على البروتينات التي تعرضت لتغيير طبيعتها، ويُظهر نشاطًا طبيعيًا حتى في وجود 1% من BME و0.5% من SDS. س: هل يمكنني هضم كل من PNGase F وO-Glycosidase معًا؟ ج: نعم. باتباع شروط التفاعل المذكورة في السؤال رقم 3 من الأسئلة الشائعة، ستجد أنه تم تحديد شروط تسمح باستخدام O-glycosidase في ظل نفس ظروف تغيير الطبيعة المستخدمة مع PNGase F. يمكن استخدام كل من PNGase F وO-glycosidase معًا في تفاعل مع محلول التفاعل G7 بتركيز 1X، وNP40 بتركيز 10%، وإنزيم النيورامينيداز، والماء، والبروتين السكري الخاص بك. س: ما الفرق بين PNGase F وEndo H وO-Glycosidase؟ ج: يزيل إنزيم PNGase F جميع أنواع الغلكزة المرتبطة بالنيتروجين (المرتبطة بالأسباراجين)؛ بما في ذلك الغلكزة عالية المانوز، والهجينة، وثنائية وثلاثية ورباعية التفرع. يُنصح باختيار هذا الإنزيم إذا كان الهدف هو إزالة جميع الكربوهيدرات المرتبطة بالنيتروجين بغض النظر عن نوعها. أما إنزيم Endo H فيزيل فقط الغلكزة عالية المانوز وبعض أنواع الكربوهيدرات الهجينة المرتبطة بالنيتروجين. يُنصح باختيار هذا الإنزيم لتحديد نوع الغلكزة المرتبطة بالنيتروجين بدقة أكبر، أو إذا كان البروتين يحتوي على كربوهيدرات حساسة لإنزيم Endo H. يزيل إنزيم O-Glycosidase من شركة NEB ثنائيات السكاريد المرتبطة بالنيتروجين من النوعين الأساسيين 1 و3 منزوعة حمض السياليك والمرتبطة ببقايا السيرين/الثريونين. س: لماذا تم تغيير محاليل التفاعل لإنزيمات NEB Glycosidase؟ ما هي محاليل التفاعل الجديدة، وهل لا يزال بإمكاني استخدام الإنزيم مع محلوله القديم؟ أين يمكنني العثور على تركيبة المحاليل القديمة؟ ج: لتبسيط سير العمل وعمليات الهضم باستخدام اثنين أو أكثر من الإكسوغليكوزيدازات، تُزوَّد معظم الإنزيمات الآن بمحلول غليكوبفر 1 بتركيز 10X. ويُستثنى من ذلك إنزيمان يُزوَّدان بمحلول غليكوبفر 4. كما تم تبسيط مجموعة المحاليل المنظمة للإندوغليكوزيدازات. وقد تم تقييم نشاط كل إنزيم من الإندوغليكوزيدازات والإكسوغليكوزيدازات في كلٍّ من نظام المحلول المنظم القديم والجديد. احتفظت جميع الإنزيمات إما بنفس النشاط، أو وُجد أن نشاطها أكبر في المحلول المنظم الجديد. لا تزال بعض الإكسوغليكوزيدازات تُزوَّد بقارورة إضافية من rHSA (يعزز rHSA نشاط بعض الإنزيمات). وكما كان الحال سابقًا، لا تزال بعض الإكسوغليكوزيدازات تُزوَّد بقارورة إضافية من BSA (يعزز BSA نشاط بعض الإنزيمات). ولا تزال المكونات الأخرى (مثل محلول تمسخ البروتين السكري، وNP-40، وما إلى ذلك) متوفرة عند الحاجة. رقم منتج الإنزيم، المحلول المنظم القديم، المحلول المنظم الحالي، هل تم التغيير؟ إنزيم ألفا-إن-أسيتيل جالاكتوزامينيداز P0734 G7 جليكوبافر 1 نعم، إنزيم ألفا1-2 فوكوسيداز P0724 G4 جليكوبافر 1 نعم، إنزيم ألفا1-2،3،4،6 فوكوسيداز P0748 --- جليكوبافر 1 --- إنزيم ألفا1-2،4،6 فوكوسيداز O p0749 --- جليكوبافر 1 --- إنزيم ألفا1-3،4 فوكوسيداز p0769 --- جليكوبافر 1 --- إنزيم ألفا1-2،3 مانوسيداز P0729 G6 جليكوبافر 1 لا، إنزيم ألفا1-6 مانوسيداز P0727 G2 جليكوبافر 1 نعم، إنزيم ألفا1-2،3،6 مانوسيداز p0768 --- جليكوبافر 4 --- غالاكتوزيداز α1-3,4,6 P0747 --- غليكوبافر 1 ---- غالاكتوزيداز α1-3,6 P0731 G6 غليكوبافر 1 لا نيورامينيداز α2-3 S P0743 --- غليكوبافر 1 --- نيورامينيداز α2-3,6,8 P0720 G1 غليكوبافر 1 نعم نيورامينيداز α2-3,6,8,9 A P0722 --- غليكوبافر 1 --- β-N-أسيتيل هيكسوزامينيداز P0721 G2 غليكوبافر 1 نعم β-N-أسيتيل غلوكوزامينيداز P0732 G1 غليكوبافر 1 نعم β-N-أسيتيل غلوكوزامينيداز S P0744 --- غليكوبافر 1 --- β1-3 جالاكتوزيداز P0726 G6 GlycoBuffer 1 لا β1-4 جالاكتوزيداز S P0745 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3,4 جالاكتوزيداز p0746 --- GlycoBuffer 4 --- N-Glycan Sequencing Kit E0577 --- GlycoBuffer 1 --- Endo S P0741 G6 GlycoBuffer 1 نعم Endo H P0702 G5 GlycoBuffer 3 نعم Endo Hf P0703 G5 GlycoBuffer 3 نعم Endo F2 p0772 --- GlycoBuffer 4 --- Endo F3 p0771 --- GlycoBuffer 4 --- Endo D P0742 G7 GlycoBuffer 2 لا O-Glycosidase P0733 G7 مجموعة GlycoBuffer 2 بدون O-Glycosidase و Neuraminidase E0540 G7 GlycoBuffer 2 بدون Remove-iT® PNGase F P0706 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F P0704 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F (خالي من الجلسرين) P0705 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F، مُعاد التركيب P0708 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F (خالي من الجلسرين)، مُعاد التركيب P0709 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase A p0707 --- Glyco Buffer 3 --- مزيج إزالة الغليكوزيل من البروتين II p6044 --- مزيج إزالة الغليكوزيل Buffer 1 و 2 --- Rapid PNGase F P0710 --- Rapid PNGase F Buffer ---- Rapid™ PNGase F (صيغة غير مُختزلة) p0711 --- محلول منظم سريع لإنزيم PNGase F (صيغة غير مختزلة) س: ما هي الجليكوسيدازات وما استخداماتها؟ ج: تُستخدم الجليكوسيدازات للحصول على معلومات حول مجموعات الكربوهيدرات المرتبطة بالبروتينات السكرية والببتيدات السكرية. وهي نوعان: إندوجليكوسيدازات التي تفصل مجموعات الكربوهيدرات بالكامل عن البروتينات، وإكسوجليكوسيدازات التي تزيل السكريات الأحادية من النهايات غير المختزلة للكربوهيدرات. أما النهاية المختزلة فهي تلك التي يُنتجها إندوجليكوسيداز. غالبًا ما يستخدم الباحثون إندوجليكوسيداز متبوعًا بواحد أو أكثر من الإكسوجليكوسيدازات، ثم يحللون النواتج باستخدام SDS-PAGE أو أنواع مختلفة من الكروماتوغرافيا السائلة. س: هل من الضروري معالجة البروتين السكري الخاص بي في الوقت نفسه باستخدام نيورامينيداز وO-جليكوسيداز؟ ج: نعم. يجب إزالة بقايا حمض النيورامينيك لتمكين إنزيم O-جليكوسيداز من شطر ثنائيات السكاريد المرتبطة بروابط O. يعمل إنزيم نيورامينيداز عام (NEB #P0720) بكفاءة. كما يتوفر أيضًا مزيج من إنزيم O-جليكوسيداز وإنزيم نيورامينيداز (NEB# E0540S). س: كيف يمكنني تثبيط إنزيم O-جليكوسيداز؟ ج: يعمل SDS على تثبيط إنزيم O-جليكوسيداز. س: هل يحتوي إنزيم O-جليكوسيداز على علامة تنقية بالتقارب؟ ج: نعم، يحتوي إنزيم O-جليكوسيداز على علامة هيكساهيستيدين في الطرف الكربوكسيلي (6xHis-tag).