مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، P0741L، إندو إس

إن إندو إس هو إنزيم إندوغليكوزيداز متخصص في فصل السكريات المرتبطة بالنيتروجين من لب الكيتوبيوز للسلسلة الثقيلة من الغلوبولين المناعي IgG الأصلي. الفئات ذات الصلة: إنزيمات إندوغليكوزيداز، تطبيقات تحليل البروتينات، العلاجات الحيوية وتحليل الأجسام المضادة، أنظمة التعبير، تسلسل السكريات، تعريف الوحدة: تُعرف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لإزالة أكثر من 95% من الكربوهيدرات من 5 ميكروغرام من الغلوبولين المناعي IgG أحادي النسيلة الأصلي للفأر في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول جليكوبازر 1 بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول جليكوبازر 1 بتركيز 1X، 5 ملي مولار كلوريد الكالسيوم، 50 ملي مولار أسيتات الصوديوم (الأس الهيدروجيني 5.5 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين : 20 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 50 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 5 ملي مولار إيديتات ثنائي الصوديوم، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري : 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الوزن الجزيئي الظاهري : 136 كيلو دالتون . شروط فحص الوحدة : يُحضن 5 ميكروغرام من IgG في محلول جليكوبازر 1 بتركيز 1X مع تخفيفات متسلسلة من Endo S لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. يتم تصوير فصل نواتج التفاعل باستخدام SDS-PAGE. الأسئلة الشائعة : س: هل Endo S موسوم؟ ج: Endo S موسوم بنطاق ربط الكيتين (CBD). تسمح علامة CBD بإزالتها من التفاعل باستخدام خرز الكيتين (NEB #S6651) أو خرز الكيتين المغناطيسي (NEB #E8036). ملاحظة: لا يوجد موقع انقسام بين إنزيم Endo S وعلامة CBD لتمكين إزالة هذه العلامة من إنزيم Endo S. س: ما الفرق بين إنزيم PNGase F وإنزيم Endo S؟ ج: يقوم إنزيم PNGase F بفصل بقايا GlcNAc و asparagine الداخلية في السكريات قليلة الوحدات عالية المانوز، والهجينة، والمعقدة من البروتينات السكرية المرتبطة بـ N. بينما يتميز إنزيم Endo S بخصوصية عالية لإزالة السكريات المرتبطة بـ N داخل لب الكيتوبيوز في IgG الطبيعي. س: ما هي كمية إنزيم Endo S التي يجب استخدامها لإزالة السكريات من البروتين السكري في الظروف الطبيعية؟ ج: عند العمل مع IgG الطبيعي، نوصي باستخدام 1 ميكرولتر من إنزيم Endo S لكل 100 ميكروغرام من IgG الطبيعي. عند العمل مع البروتينات السكرية المختلفة الأخرى (مثل فيتوين)، نوصي باستخدام بروتوكول تمسخ معدل، موضح بالتفصيل أدناه. امزج 100 ميكروغرام من البروتين السكري، و1 ميكرولتر من محلول DTT بتركيز 400 ملي مولار، والماء (إذا لزم الأمر) للوصول إلى حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر. قم بتعطيل البروتين السكري بتسخين التفاعل عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ارفع حجم التفاعل الإجمالي إلى 20 ميكرولتر بإضافة 2 ميكرولتر من محلول GlycoBuffer 1 بتركيز 10X، والماء، و1-2 ميكرولتر من إنزيم Endo S. حضّن التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ملاحظة: لإزالة الغليكوزيل من بعض البروتينات السكرية، قد يلزم وقت حضانة أطول وكمية أكبر من الإنزيم. يمكن زيادة حجم التفاعلات خطيًا لاستيعاب أحجام تفاعل أكبر. س: ما هو الركيزة المفضلة لإنزيم Endo S؟ ج: IgG هو الركيزة المفضلة. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت الدراسات المنشورة أن إنزيم Endo S لا يحلل IgM أو IgA في مصل الدم البشري. * * كولين، م. أولسن، أ. إندو إس، بروتين مُفرز جديد من المكورات العقدية المقيحة ذو نشاط إندوغليكوزيداز على الغلوبولين المناعي البشري IgG. مجلة EMBO (2001) المجلد 20، العدد 12، الصفحات 3046-3055. س: ما هي ظروف التفاعل النموذجية لإندو إس؟ ج: ظروف التفاعل النموذجية هي كما يلي: يجب تحديد أوقات الحضانة المثلى وتركيزات الإنزيم تجريبيًا لركيزة معينة. امزج 100 ميكروغرام من الغلوبولين المناعي IgG الأصلي، و1 ميكرولتر من محلول غليكوبافر 1 بتركيز 10X، والماء (إذا لزم الأمر) للحصول على حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر. أضف 1 ميكرولتر من إندو إس. حضّن التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ملاحظة: يمكن زيادة حجم التفاعلات خطيًا لاستيعاب أحجام تفاعل أكبر. س: كيف يمكنني إزالة إندو إس من التفاعل؟ ج: يمكن إزالة إندو إس من تفاعل إزالة الغليكوزيل باستخدام خرز الكيتين المغناطيسي من NEB. فيما يلي ظروف التفاعل النموذجية لإزالة 1-5 ميكرولتر من Remove-iT® Endo S باستخدام خرز الكيتين المغناطيسي: المواد: Endo S (NEB #P0741)، خرز الكيتين المغناطيسي (NEB #E8036)، حامل الفصل المغناطيسي (NEB #S1506 أو NEB #S1509). ضع 50 ميكرولتر من خرز الكيتين المغناطيسي في أنبوب إيبندورف، ثم ضع الأنبوب في حامل الفصل المغناطيسي. دع المغناطيس يجذب خرز الكيتين، ثم اسحب السائل الطافي وتخلص منه. مع بقاء أنبوب الإيبندورف على حامل الفصل المغناطيسي، اغسل خرز الكيتين المغناطيسي مرتين (500 ميكرولتر في كل مرة) بمحلول فورمات الأمونيوم 50 ملي مولار عند درجة حموضة 4.4 (أو محلول منظم من اختيارك). اسحب السائل الطافي وتخلص منه. أضف عينة البروتين السكري منزوع الغليكوزيل إلى أنبوب الإيبندورف المزود بالمغناطيس. خرز الكيتين. رجّ عينة البروتين السكري منزوع الغليكوزيل مع خرز الكيتين المغناطيسي لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 مئوية. أعد وضع أنبوب إيبندورف على حامل الفصل المغناطيسي، واترك المغناطيس يجذب خرز الكيتين. اسحب السائل الطافي باستخدام ماصة واحتفظ به. اغسل خرز الكيتين المغناطيسي 3 مرات (3 × 100 ميكرولتر) بمحلول فورمات الأمونيوم 50 ملي مولار عند درجة حموضة 4.4 (أو محلول منظم من اختيارك). اسحب السائل الطافي من كل غسلة واحتفظ به. اجمع جميع السوائل الطافية من الخطوتين 5 و6، لأنها تمثل البروتين السكري منزوع الغليكوزيل. حلل العينة بالطريقة التي تختارها. ملاحظة: يمكن زيادة إزالة إنزيم Endo S من تفاعل إزالة الغليكوزيل خطيًا بزيادة حجم خرز الكيتين المغناطيسي. س: ما هي قدرة ارتباط خرز الكيتين المغناطيسي المستخدم لإزالة إنزيم Endo S؟ ج: تبلغ قدرة ارتباط خرز الكيتين المغناطيسي (NEB# E8036) حوالي 0.4 ملغم/مل من البروتين الموسوم بـ CBD. تُحسب سعة الارتباط هذه بوحدة ملليغرام من البروتين لكل حجم من الراتنج. حبيبات الكيتين المغناطيسية عبارة عن معلق بنسبة 50:50. لذلك، فإن 50 ميكرولتر من المعلق ستنتج 25 ميكرولتر من حجم الراتنج، وهو ما يكفي لإزالة 1-5 ميكرولتر من إنزيم Endo S. س: هل إنزيم Endo S متوافق مع التحليلات اللاحقة مثل HPLC وقياس الطيف الكتلي؟ ج: يُزوَّد إنزيم Endo S في محلول تخزين مناسب لقياس الطيف الكتلي وخالٍ من الجلسرين. يمكن استخدام إنزيم Endo S في ظروف التفاعل الأصلية أو ظروف تفاعل DTT (انظر السؤال 3)، وكلاهما متوافق مع التحليلات اللاحقة باستخدام HPLC وقياس الطيف الكتلي. س: لماذا غيّرت إنزيمات NEB Glycosidase محاليل التفاعل؟ ما هي محاليل التفاعل الجديدة، وهل لا يزال بإمكاني استخدام الإنزيم مع محلوله القديم؟ أين يمكنني العثور على تركيبة المحاليل القديمة؟ ج: لتبسيط سير العمل وعمليات الهضم باستخدام اثنين أو أكثر من إنزيمات exoglycosidase، يتم الآن تزويد معظم الإنزيمات بـ محلول غليكوبافر 1 بتركيز 10X. يتوفر استثناءان مع محلول غليكوبافر 4. كما تم تبسيط لوحة المحاليل المنظمة للإنزيمات الداخلية المحللة للسكريات. تم تقييم نشاط كل إنزيم من الإنزيمات الداخلية والخارجية المحللة للسكريات في كل من نظام المحلول المنظم القديم والجديد. احتفظت جميع الإنزيمات إما بنفس النشاط، أو وُجد أن نشاطها أكبر في المحلول المنظم الجديد. لا تزال بعض الإنزيمات الخارجية المحللة للسكريات مزودة بقارورة إضافية من rHSA (يعزز rHSA نشاط بعض الإنزيمات). كما في السابق، لا تزال بعض الإنزيمات الخارجية المحللة للسكريات مزودة بقارورة إضافية من BSA (يعزز BSA نشاط بعض الإنزيمات). لا تزال المكونات الأخرى (مثل محلول تسييل البروتينات السكرية، NP-40، إلخ) متوفرة عند الحاجة. رقم المنتج الإنزيمي، المحلول المنظم القديم، المحلول المنظم الحالي، هل تم التغيير؟، α-N-أسيتيل غالاكتوزامينيداز، P0734، G7، غليكوبافر 1، نعم، α1-2 فوكوسيداز P0724 G4 غليكوبافر 1 نعم α1-2,3,4,6 فوكوسيداز P0748 --- غليكوبافر 1 --- α1-2,4,6 فوكوسيداز O p0749 --- غليكوبافر 1 --- α1-3,4 فوكوسيداز p0769 --- غليكوبافر 1 --- α1-2,3 مانوسيداز P0729 G6 غليكوبافر 1 لا α1-6 مانوسيداز P0727 G2 غليكوبافر 1 نعم α1-2,3,6 مانوسيداز p0768 --- غليكوبافر 4 --- α1-3,4,6 غالاكتوزيداز P0747 --- غليكوبافر 1 ---- α1-3,6 غالاكتوزيداز P0731 G6 GlycoBuffer 1 لا يوجد α2-3 نيورامينيداز S P0743 --- GlycoBuffer 1 --- α2-3,6,8 نيورامينيداز P0720 G1 GlycoBuffer 1 نعم α2-3,6,8,9 نيورامينيداز A P0722 --- GlycoBuffer 1 --- β-N-أسيتيل هيكسوزامينيداز F P0721 G2 GlycoBuffer 1 نعم β-N-أسيتيل جلوكوزامينيداز P0732 G1 GlycoBuffer 1 نعم β-N-أسيتيل جلوكوزامينيداز S P0744 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3 جالاكتوزيداز P0726 G6 GlycoBuffer 1 لا يوجد β1-4 جالاكتوزيداز S P0745 --- غليكوبافر 1 --- β1-3,4 غالاكتوزيداز p0746 --- غليكوبافر 4 --- مجموعة تسلسل N-غليكان E0577 --- غليكوبافر 1 --- إندو إس P0741 G6 غليكوبافر 1 نعم إندو إتش P0702 G5 غليكوبافر 3 نعم إندو إتش إف P0703 G5 غليكوبافر 3 نعم إندو إف 2 p0772 --- غليكوبافر 4 --- إندو إف 3 p0771 --- غليكوبافر 4 --- إندو دي P0742 G7 غليكوبافر 2 لا يوجد O-غليكوزيداز P0733 G7 غليكوبافر 2 لا يوجد O-غليكوزيداز وحزمة نيورامينيداز E0540 G7 غليكوبافر 2 لا يوجد Remove-iT® PNGase F P0706 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F P0704 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F (خالي من الجلسرين) P0705 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F، مُعاد التركيب P0708 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F (خالي من الجلسرين)، مُعاد التركيب P0709 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase A p0707 --- Glyco Buffer 3 --- مزيج إزالة الغليكوزيل من البروتين II p6044 --- مزيج إزالة الغليكوزيل Buffer 1 و2 --- Rapid PNGase F P0710 --- Rapid PNGase F Buffer ---- Rapid™ PNGase F (صيغة غير مُختزلة) p0711 --- Rapid PNGase F (صيغة غير مُختزلة) Buffer س: ما هي الغليكوزيدازات وما استخداماتها؟ ج: تُستخدم الغليكوزيدازات للحصول على معلومات حول مجموعات الكربوهيدرات المرتبطة بالبروتينات السكرية والببتيدات السكرية. وهي نوعان: إنزيمات التحلل السكري الداخلي التي تفصل مجموعات الكربوهيدرات الكاملة عن البروتينات، وإنزيمات التحلل السكري الخارجي التي تزيل السكريات الأحادية من النهايات غير المختزلة للكربوهيدرات. أما النهاية المختزلة فهي تلك التي ينتجها إنزيم التحلل السكري الداخلي. يستخدم الباحثون عادةً إنزيم التحلل السكري الداخلي متبوعًا بواحد أو أكثر من إنزيمات التحلل السكري الخارجي، ثم يحللون النواتج باستخدام تقنية الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE أو أنواع مختلفة من الاستشراب السائل.