مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، P0742S، إندو دي

تم إيقاف إنتاج الحجم الكبير من هذا المنتج في 15 يونيو 2025. وسيظل الحجم الصغير متوفرًا. الفئات ذات الصلة : الإندوغليكوزيداز، تطبيقات تحليل البروتينات، أنظمة التعبير، تسلسل الغليكان، علم البروتينات، تعريف وحدة المواصفات : تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لإزالة أكثر من 95% من الكربوهيدرات من 10 ميكروغرام من فيتوين (المركز ثلاثي المانوزيل) المُزال منه الغليكوزيداز خلال ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول غليكوبافر 2 بتركيز 1X، حضانة عند 37 درجة مئوية. محلول غليكوبافر 2 بتركيز 1X، فوسفات الصوديوم 50 ملي مولار (الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 20 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 50 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار إيدتا، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري : 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الوزن الجزيئي الظاهري : 140 كيلو دالتون . شروط فحص الوحدة: يتم تسخين 10 ميكروغرام من فيتوين (ذو النواة ثلاثية المانوز) بعد إزالة الجليكوزيداز، باستخدام داي ثيو ثريتول بتركيز 1X عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. بعد إضافة محلول غليكوبافر 2 بتركيز 1X، يتم إضافة تخفيفات متسلسلة من إنزيم إندو دي، ويُحضن مزيج التفاعل لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. يتم تصوير فصل نواتج التفاعل باستخدام الرحلان الكهربائي الهلامي SDS-PAGE. الأسئلة الشائعة : س: ما هي العلامة الموجودة على إنزيم Endo D؟ ج: إنزيم Endo D مُعلّم بنطاق ربط الكيتين (CBD). تسمح علامة CBD بإزالته من التفاعل باستخدام خرزات الكيتين المغناطيسية (NEB #E8036). ملاحظة: لا يوجد موقع انقسام بين إنزيم Endo D وعلامة CBD لتمكين إزالة هذه العلامة من إنزيم Endo D. س: ما الفرق بين PNGase F و Endo S و Endo D؟ ج: يقوم إنزيم PNGase F بالقطع بين بقايا GlcNAc و asparagine الداخلية في السكريات قليلة التعدد عالية المانوز، والهجينة، والمعقدة من البروتينات السكرية المرتبطة بـ N. يتميز إنزيم Endo S بخصوصية عالية لإزالة السكريات المرتبطة بـ N داخل لب الكيتوبيوز في IgG الأصلي. بينما يقوم إنزيم Endo D بالقطع داخل لب الكيتوبيوز في السكريات قليلة المانوز المرتبطة بـ N من البروتينات السكرية والببتيدات السكرية، سواء كانت ذات امتدادات في الهوائيات أم لا. س: ما هو بروتوكول التفاعل النموذجي لـ Endo D؟ ج: نوصي باستخدام 1 ميكرولتر من Endo D لكل 20 ميكروغرام من السكريات المرتبطة بـ N من نوع paucimannose. امزج 10-20 ميكروغرام من البروتين السكري، و1 ميكرولتر من محلول DTT بتركيز 10X، والماء (إذا لزم الأمر) لتكوين حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر. قم بتعطيل البروتين السكري بتسخين التفاعل عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. حضّر حجم تفاعل إجمالي قدره 20 ميكرولتر بإضافة 2 ميكرولتر من محلول GlycoBuffer 2 بتركيز 10X، والماء، و1 ميكرولتر من إنزيم Endo D. حضّن التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ملاحظة: لإزالة الغليكوزيل من البروتينات السكرية المختلفة في الظروف الطبيعية، قد يلزم وقت حضانة أطول وكمية أكبر من الإنزيم. يمكن زيادة حجم التفاعلات خطيًا لاستيعاب أحجام تفاعل أكبر. س: هل يثبط SDS إنزيم Endo D؟ ج: نعم، يثبط SDS إنزيم Endo D، وعلى عكس إنزيمات الغليكوزيداز الداخلية الأخرى، لا يُعاكس NP-40 تثبيط SDS. لذلك، فإن إنزيم Endo D ليس يُوصى باستخدامه مع محلول NEB المُزيل لطبيعة البروتينات السكرية، والذي يحتوي على كلٍ من SDS وDTT. يُباع الإنزيم مع محلول DTT بتركيز 10X لأغراض إزالة الطبيعة دون SDS. س: كيف يُمكنني إزالة Endo D من التفاعل؟ ج: يُمكن إزالة Endo D من تفاعل إزالة السكريات باستخدام خرز الكيتين المغناطيسي من NEB (NEB #E8036). فيما يلي ظروف التفاعل النموذجية لإزالة 1-5 ميكرولتر من Remove-iT® Endo D باستخدام خرز الكيتين المغناطيسي: المواد: Endo D (NEB #P0742)، خرز الكيتين المغناطيسي (NEB #E8036)، حامل الفصل المغناطيسي (NEB #S1506، NEB #S1509). ضع 50 ميكرولتر من خرز الكيتين المغناطيسي في أنبوب إيبندورف، ثم ضع الأنبوب في حامل الفصل المغناطيسي. دع المغناطيس يجذب خرز الكيتين، ثم اسحب السائل باستخدام الماصة. تخلص من السائل الطافي. ضع أنبوب إيبندورف على حامل الفصل المغناطيسي، واغسل حبيبات الكيتين المغناطيسية مرتين (500 ميكرولتر لكل مرة) بمحلول فورمات الأمونيوم 50 ملي مولار، درجة الحموضة 4.4 (أو أي محلول منظم من اختيارك). اسحب السائل الطافي باستخدام ماصة وتخلص منه. أضف عينة البروتين السكري منزوع الغليكوزيل إلى أنبوب إيبندورف مع حبيبات الكيتين المغناطيسية. رجّ عينة البروتين السكري منزوع الغليكوزيل مع حبيبات الكيتين المغناطيسية لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 مئوية. أعد وضع أنبوب إيبندورف على حامل الفصل المغناطيسي، واترك المغناطيس يجذب حبيبات الكيتين. اسحب السائل الطافي باستخدام ماصة واحتفظ به. اغسل حبيبات الكيتين المغناطيسية ثلاث مرات (100 ميكرولتر لكل مرة) بمحلول فورمات الأمونيوم 50 ملي مولار، درجة الحموضة 4.4 (أو أي محلول منظم من اختيارك). اسحب السائل الطافي من كل غسلة واحتفظ به. اجمع جميع السوائل الطافية من الخطوتين 5 و6، لأنها تمثل البروتين السكري منزوع الغليكوزيل. حلل العينة بالطريقة التي تختارها. ملاحظات: يمكن زيادة إزالة إنزيم Endo D من تفاعل إزالة الغليكوزيل بشكل خطي بزيادة حجم حبيبات الكيتين المغناطيسية. حجم التفاعل المثالي لـ 50 ميكرولتر من راتنج الكيتين يتراوح بين حجم مساوٍ لحجم طبقة الحبيبات وخمسة أضعاف حجمها كحد أقصى. س: ما هي قدرة ارتباط حبيبات الكيتين المغناطيسية المستخدمة لإزالة إنزيم Endo D؟ ج: تبلغ قدرة ارتباط حبيبات الكيتين المغناطيسية (NEB# E8036) حوالي 0.4 ملغم/مل من البروتين الموسوم بـ CBD. تُحسب قدرة الارتباط هذه بوحدة ملغم من البروتين لكل حجم طبقة من الراتنج. حبيبات الكيتين المغناطيسية عبارة عن معلق بنسبة 50:50. لذلك، سينتج عن 50 ميكرولتر من المعلق 25 ميكرولتر من حجم طبقة الراتنج، وهو ما يكفي لإزالة 1-5 ميكرولتر من إنزيم Endo D. س: هل إنزيم Endo D متوافق مع التحليلات اللاحقة مثل HPLC وقياس الطيف الكتلي؟ ج: يتم توفير إنزيم Endo D في محلول تخزين خالٍ من الجلسرين، مناسب لتحليل الطيف الكتلي. يمكن استخدام إنزيم Endo D في ظروف التفاعل الطبيعية أو مع DTT (انظر السؤال 3)، وكلاهما متوافق مع تحليل HPLC وMS اللاحق. س: لماذا غيّرت إنزيمات NEB Glycosidase محاليل التفاعل؟ ما هي محاليل التفاعل الجديدة، وهل ما زال بإمكاني استخدام الإنزيم مع محلوله القديم؟ أين يمكنني العثور على تركيبة المحاليل القديمة؟ ج: لتبسيط إجراءات العمل والهضم باستخدام اثنين أو أكثر من إنزيمات exoglycosidase، يتم الآن تزويد معظم الإنزيمات بمحلول GlycoBuffer 1 بتركيز 10X. ويُستثنى من ذلك إنزيمان مزودان بمحلول GlycoBuffer 4. كما تم تبسيط مجموعة محاليل إنزيمات endoglycosidase. تم تقييم نشاط كل إنزيم endo- وexoglycosidase في كل من نظام المحلول القديم والجديد. احتفظت جميع الإنزيمات إما بنفس النشاط، أو وُجد أن نشاطها أكبر في المحلول الجديد. لا تزال بعض إنزيمات exoglycosidase مزودة بقارورة إضافية من rHSA (يعزز rHSA نشاط بعض الإنزيمات). كما في السابق، لا تزال بعض الإكسوغليكوزيدازات مزودة بقارورة إضافية من BSA (يعزز BSA نشاط بعض الإنزيمات). ولا تزال المكونات الأخرى (مثل محلول إزالة طبيعة البروتين السكري، NP-40، إلخ) متوفرة عند الحاجة. رقم المنتج الإنزيمي، المحلول القديم، المحلول الحالي، هل تم التغيير؟ α-N-أسيتيل جالاكتوزامينيداز P0734 G7، محلول غليكوبافر 1، نعم. α1-2 فوكوزيداز P0724 G4، محلول غليكوبافر 1، نعم. α1-2,3,4,6 فوكوزيداز P0748 ---، محلول غليكوبافر 1 ---. α1-2,4,6 فوكوزيداز O p0749 ---، محلول غليكوبافر 1 ---. α1-3,4 فوكوزيداز p0769 ---، محلول غليكوبافر 1 ---. مانوسيداز α1-2,3 P0729 G6 GlycoBuffer 1 لا، مانوسيداز α1-6 P0727 G2 GlycoBuffer 1 نعم، مانوسيداز α1-2,3,6 p0768 --- GlycoBuffer 4 --- جالاكتوزيداز α1-3,4,6 P0747 --- GlycoBuffer 1 ---- جالاكتوزيداز α1-3,6 P0731 G6 GlycoBuffer 1 لا، نيورامينيداز α2-3 S P0743 --- GlycoBuffer 1 --- نيورامينيداز α2-3,6,8 P0720 G1 GlycoBuffer 1 نعم، نيورامينيداز α2-3,6,8,9 A P0722 --- GlycoBuffer 1 --- β-N-أسيتيل هيكسوزامينيداز P0721 G2 GlycoBuffer 1 نعم β-N-أسيتيل جلوكوزامينيداز P0732 G1 GlycoBuffer 1 نعم β-N-أسيتيل جلوكوزامينيداز S P0744 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3 جالاكتوزيداز P0726 G6 GlycoBuffer 1 لا β1-4 جالاكتوزيداز S P0745 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3,4 جالاكتوزيداز p0746 --- GlycoBuffer 4 --- N-Glycan Sequencing Kit E0577 --- GlycoBuffer 1 --- Endo S P0741 G6 GlycoBuffer 1 نعم Endo H P0702 G5 GlycoBuffer 3 نعم Endo Hf P0703 G5 GlycoBuffer 3 نعم Endo F2 p0772 --- GlycoBuffer 4 --- Endo F3 p0771 --- GlycoBuffer 4 --- Endo D P0742 G7 GlycoBuffer 2 بدون O-Glycosidase P0733 G7 GlycoBuffer 2 بدون O-Glycosidase & Neuraminidase Bundle E0540 G7 GlycoBuffer 2 بدون Remove-iT® PNGase F P0706 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F P0704 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F (خالي من الجلسرين) P0705 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F، مُعاد التركيب P0708 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F (خالي من الجلسرين)، مُعاد التركيب P0709 G7 محلول غليكو 2 بدون إنزيم PNGase A p0707 --- محلول غليكو 3 --- مزيج إزالة الغليكوزيل من البروتين II p6044 --- محلول مزيج إزالة الغليكوزيل 1 و2 --- إنزيم PNGase F السريع P0710 --- محلول إنزيم PNGase F السريع ---- إنزيم PNGase F السريع™ (صيغة غير مختزلة) p0711 --- محلول إنزيم PNGase F السريع (صيغة غير مختزلة) س: هل يستطيع إنزيم Endo D شطر البروتينات السكرية في الظروف الطبيعية؟ ج: نعم، يستطيع إنزيم Endo D شطر السكريات من بعض البروتينات السكرية في الظروف الطبيعية إذا تم تقليم بنية السكريات إلى النواة ثلاثية المانوز. على سبيل المثال، تم تحضين 10 ميكروغرام من ريتوكسيماب (جسم مضاد IgG1 بشري/فأري هجين) مع الجليكوزيدازات التالية: 50 وحدة من إنزيم نيورامينيداز A α2-3,6,8,9 (NEB) #P0722)، 8 وحدات من β1-4 جالاكتوزيداز S (NEB #P0745)، 8 وحدات من β-N-أسيتيل جلوكوزامينيداز S (NEB #P0744) و250 وحدة من إندو D (NEB #P0742) في محلول جليكوبازر 1X، وحُضنت العينات طوال الليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. وقد أدى ذلك إلى إزالة الجليكان بالكامل من الجسم المضاد.